מכאן שהרפואה המשולבת, זו המנסה לעשות שימוש בשני העולמות, הקונבנציונלי והאלטרנטיבי, מתמקדת באדם לא פחות מאשר במחלה. ...
מתוך הערך: המדריך לטיפול בסוכרת

חלבון 14-3-3eta

מתוך ויקירפואה

     מדריך בדיקות מעבדה      
חלבון 14-3-3η
'
 שמות אחרים  חלבון 14-3-3eta, IdentRA
מעבדה כימיה בדם ובנוזל השדרה
תחום סיוע לאבחון מחלת Creutzfeldt–Jakob, ולאבחון דלקת מפרקים שגרונית (RA).
Covers bdikot.jpg
 
טווח ערכים תקין בנסיוב-פחות מ-0.20 ננוגרם/מ"ל; ב-CSF- פחות מ-2.0 ננוגרם/מ"ל
יוצר הערך פרופ' בן-עמי סלע

מטרת הבדיקה

תמיכה, בשילוב עם בדיקות אחרות, באבחון של מחלת Creutzfeldt-Jakob במטופלים עם שיטיון המתקדם במהירות, כאשר תרחישים נוירו-ניווניים אחרים נשללו. כמו כן מוסכם שרמת 14-3-3η בנסיוב יכולה לסייע באבחון של RA.

תכונות חלבוני 14-3-3

חלבוני 14-3-3 הם משפחה של מולקולות רגולטוריות משוּמרוֹת המבוטאות בכל התאים האאוקריוטיים (Mhawech ב- Cell Resמשנת 2005). חלבוני 14-3-3 הם בעלי יכולת לקשור מספר ניכר של חלבוני איתות מתפקדים, כולל קינאזות, פוספטאזות, וקולטנים טרנס-ממברנליים. למעלה מ-200 חלבוני איתות דווחו כליגנדים מסוג 14-3-3 (תרשים למטה):

3eta-1.png

מסלולי האיתות של 14-3-3η

ישנם 7 גנים המקודדים ל-7 איזופורמים של חלבוני 14-3-3 ברוב היונקים. שבעה איזופורמים אלה הם: α/β, γ, /ζδ, ε, η, θ/τ ו-σ. חלבונים משומרים אלה חומציים ב-pH פיזיולוגי, והם בעלי משקל מולקולארי של 25,000–30,000 דלטון, ויש להם הומולוגיה של בערך 50% בין שבעת האיזופורמים. חלבוני 14-3-3 מתקיימים in vivo כדימרים של איזופורמים שונים. בהרצה אלקטרופורטית ב-SDS gel-polyacrylamide בתנאים מחזרים מתקבלת הערכה של משקל מולקולארי של 25,000–30,000 דלטון, ואילו בהרצה על עמודת Sephadex, הערכת המשקל המולקולארי היא של 50,000–60,000 דלטון. האיזופורמים β, γ ו- θ נמצאים ברקמות של מערכת העצבים. הגן המקודד ל-14-3-3η הוא YWHAH הממוקם על כרומוזום 22 בעמדה 31.94-31.96.

אאוקריוטים יכולים לשאת אובדן של גן בודד של 14-3-3 אם כל הגנים האחרים מבוטאים. עם זאת, שמט של כל 7 הגנים המקודדים לחלבוני 14-3-3 הוא קטלני. חלבוני 14-3-3 יכולים להיחשב כחברים מפותחים של משפחת-העל TRP או tetratrico peptide repeat, המכילים באופן כללי 9–10 סלילוני α, עם חומצות אמינו משתנות בקצוות ה-N וה-C טרמינליים, ויוצרים בדרך כלל אינטראקציות בין הומו והטרו-דימרים לאורך הסלילונים בקצוות ה-N טרמינאליים. חלבונים אלה מכילים מספר לא ידוע של מקטעים הנתונים לשינוי, הכוללים אזורים לאינטראקציות עם קטיונים דן-ערכיים, אזורים החשופים לפוספורילציה ואצטילציה, וכן רגישים לביקוע פרוטאוליטי. האינטראקציות האמורות מתרחשות לאורך מה שקרוי binding groove או binding cleft, שהוא באופיו amphipathic. המבנה הגבישי של 6 קבוצות של חלבונים אלה פוענח. דרך ה-binding groove האמור, חלבוני 14-3-3 מגיבים עם למעלה מ-200 חלבונים תוך-תאיים, ובכך לשלוט על מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים כולל סינתזת ותנועת חלבונים, מטבוליזם תאי והעברת איתותים. חלבוני 14-3-3 משפעלים אנזימי P-type H+ ATPases ממברנאליים, על ידי שהם נקשרים לשייר תראונין בקצה ה-C טרמינלי של אנזימים אלה (Jahn ב-,J Biol Chem משנת 2002).

צביעה עם נוגדנים כנגד 14-3-3 מסומנים ב-FITC (גרגור ירוק) של תאים


צביעה אימונופלואורסצנטית בה חלבוני 14-3-3 בציטופלזמה נצבעים בגרגור אדום.

תפקיד חלבוני 14-3-3

ההתייחסות ל-14-3-3η היא כאל chaperonin שהוא חלבון המספק מצבים נוחים לתיקון של קיפול (folding) בלתי אידיאלי של חלבונים אחרים, ובכך מונע צימות (aggregation) של חלבונים אלה. האיזופורם 14-3-3η מופרש בעיקר על ידי ה-exosomes כיוון שנמצא שחלבוני 14-3-3 מהווים מרכיב נכבד באברונים אלה (Chavez-Munoz וחב' ב-J Cell Physiol משנת 2009, ו-Thery וחב' ב-Nature Rev Immunol משנת 2009).

לאחר הפרשתו של 14-3-3η, הוא פועל לעידוד הייצור של אנזימים ממשפחת ה-metalloproteinase כמו גם ייצורם של ציטוקינים דלקתיים נוספים (Makymowych וחב' ב-Athritis Rheum משנת 2012). 14-3-3η מסיס פועל דרך מפלי איתות (cascades) כמו קינאזות חוץ-תאיות ומסלול של p38 לשדרוג של ציטוקינים תומכי-דלקת, כולל IL-1β, IL-6, TNF-α וגורמים הכרוכים בהרס המפרק כמו MMP-9 ו-RANKL או receptor activator of nuclear factor-κB (Maksymowych וחב' ב-Arthritis Res Ther משנת 2014).

רמות 14-3-3η בנסיוב כרוכות בחומרה ובתוצאות הקליניים של RA

על פי הערכה 1.5 מיליון מבוגרים בארצות הברית סובלים מ- rheumatoid arthritis (להלן RA), עם שכיחות הגבוהה פי-2–3 בנשים יותר מאשר בגברים. אבחון מוקדם של RA קריטי למנוע את התוצאות החמורות של התפתחות המחלה. החלבון החוץ-תאי 14-3-3η נמצא כסמן הכרוך בנזק למפרקים ב-RA, כמו גם ב-psoriatic arthritis. אחד האתגרים בתחום של ארטריטיס דלקתי הוא הצורך למצוא בדיקה או סמן אמין להערכה מוקדמת של התרחיש כדי למנוע התפתחות נזק בלתי הפיך למפרק, בעידן בו מוגבל מספר הבדיקות האבחוניות להערכה זו.

הגישות האבחוניות הנוכחיות ב-RA, והופעת 14-3-3

שני המדדים המקובלים לאבחון RA הם ה- rheumatoid factor(RF), ו- anti-cyclic citrullinated peptide antibodies או anti-CCP. המגבלה של 2 טסטים אלה בהיותם מזהים לעיתים מטופלים עם מפגעים שיש ביניהם חפיפה.

כלי אבחוני לזיהוי מוקדם של ארטריטיס דלקתי, מבוסס על גילוי בנסיוב של החלבון 14-3-3η. חלבון זה מעורב בתפקודים תוך-תאיים רבים משגשוג תאים עד לוויסות של רשתות תקשור תוך תאיות, החיוניות להליכים דלקתיים אחדים הרלוונטיים ל-RA. חלבון 14-3-3η באופן רגיל הוא חלבון תוך-תאי, אך מה שאופייני בארטריטיס דלקתית היא הצורה החוץ-תאית היחידה שמופרשת של 14-3-3 וזהו האיזופורם 14-3-3η, שהוא היחיד הנמצא בנוזל החוץ-תאי, בעיקר בסינוביום, של חולים עם RA. איזופורם זה נמצא בריכוזים גבוהים בהרבה בנוזל הסינוביאלי מאשר בנסיוב, אך ניתן לגלותו בנסיוב של חולי RA או ב-psoriatic arthritis בקלות. (Maksymowych וחב' ב-Arthritis Rheun משנת 2011). יש סברה שחלבון זה מיוצר על ידי פיברובלסטים סינוביאליים, וכנראה גם על ידי מקרופאגים בסינוביום, ועיקר ריכוזם בסינוביום הוא במטופלים עם סינוביטיס דלקתית. בסביבה החוץ-תאית בריכוזים המוגברים של 14-3-3η בחולי RA, חלבון מסיס זה הוא בעל פעילות ליגנדית המשפעלת באופן מועדף תאים של מערכת החיסון הטבעית (innate).

בשנת 2007 Kilani וחב' הדגימו על ידי אנליזה בשיטת Western blot ש-14-3-3η מסיס עשוי לשמש סמן ראוי שכן הוא נמצא בריכוזים גבוהים משמעותית בנוזל הסינוביאלי ובנסיוב של חולי ארטריטיס, בהשוואה לאנשים בריאים, וכן שמות סמן זה בנסיוב תאמו בחוזקה את רמות האנזימים MMP-1ו-MMP-3 (Kilani וחב' ב-J Rheumatol משנת 2007).

Hirata וחב' פרסמו בשנת 2015 ב-Arthritis Res & Ther, את ממצאי מחקר שנועד לבחון את השימושיות של רמות 14-3-3η בנסיוב לפני תחילת הטיפול ב-149 חולי RA יפאניים ולאחר סדרת מדידות של חלבון זה במהלך שנה של טיפולים ב-methotrexate, או ב-adalimumab או ב-tocilizumab או ב-tofacitinib, כדי לבחון את יעילותם. תוצאה חיובית של רמת 14-3-3η הוגדרה כזו שמעל 0.19 ננוגרם/מ"ל. הקריטריונים של RA הוגדרו על פי סולם DAS 28 או Disease Activity Score un 28 joints בשילוב עם קצב שקיעת אריתרוציטים (ESR).

תוצאות המחקר היו כדלקמן: מטופלים עם רמות 14-3-3η מוגברות לפני תחילת הטיפולים, היו בעלי מחלה בדרגת חומרה גבוהה יותר. חיוביוּת של בדיקת 14-3-3η בשילוב עם מדידת CRP, הגדילה משמעותית את יכולת הזיהוי של חולים בדרגת חומרה מוגברת. כל ארבעת התכשירים הטיפוליים הביאו לאחר שנה אחת מתחילת הטיפול להפחתה משמעותית של רמת 14-3-3η. מטופלים בהם רמת 14-3-3η פחתה והפכה נמוכה מסף הנורמה העליון הראו תגובה קלינית משופרת לטיפול, בהשוואה למטופלים שרמת חלבון זה לא פחתה אצלם. רמות 14-3-3η לפני תחילת הטיפול, סייעו לניבוי של רמיסיה במדדי DAS28-ESR לאחר שנת טיפול עם tocilizumab, אך לא בטיפולים עם שלושת התכשירים האחרים. מסקנת בעלי המחקר הייתה ש-14-3-3η הוא סמן לזיהוי מטופלים עם RA שמחלתם חמורה.

גם Mohamed וחב' ב-MOJ Orthop Rheumatol משנת 2018, דיווחו על מחקר שנועד לקבוע יעילות של מדידת 14-3-3η בנסיוב כסמן שמגביר את הערך האבחוני של RA בשילוב עם מדידת רמות RF ו-anti cyclic citrullinated protein antibodies. מחקר זה כלל 92 מטופלים, כאשר 57 מתוכם היו בשלבים מוקדמים של RA ו-35 היו בשלבי מחלה מתקדמים. כמו כן נכללו במחקר 74 משתתפי ביקורת (18 עם psoriatic arthritis, 14 עם SLE, ו-42 אנשים בריאים).

תוצאות המחקר היו כדלקמן: רמות 14-3-3η בנסיוב בחולי RA (2.72±1.75 ננוגרם/מ"ל) היו גבוהות משמעותית בהשוואה לאנשים בריאים בהם נמצאו רמות של 0.09±0.09 ננוגרם/מ"ל (p<0.0001), וכן בהשוואה לקבוצות הביקורת האחרות בהן נרשמו רמות 14-3-3η ממוצעות של 0.14±0.21 ננוגרם/מ"ל. אנליזה של עקומת ROC הראתה ש-14-3-3η בשלבי מחלה מוקדמים נתנה ערך של 0.999 שהיה משמעותית גבוה יותר מערכי ROC לגבי רמות RF או של anti cyclic citrullinated protein antibodies (p<0.0001) (תרשים למטה). כאשר נקבע ערך cutoff של 0.39 ננוגרם/מ"ל לגבי תחום הנורמה של 14-3-3η בנסיוב, עקומת ROC מצאה לבדיקה זו רגישות של 87.7%, ספציפיות של 97.6%, ערך ניבוי חיובי (ppv) של 0.98 וערך ניבוי שלילי (npv) של 0.85. כמו כן נמצא מתאם חיובי משמעותי בין רמות 14-3-3η בנסיוב, לבין DAS28 בנבדקים בשלבי RA מוקדמים (p<0.0001).

עקומות ROC של 14-3-3η, RF ו-ACPA לאבחון של rheumatoid arthritis (לקוח מ-Mohamed.וחב' ב- MOJ Orthop Rheumatolמשנת 2018).

רמת 14-3-3η בנסיוב היא סמן מנגנוני ספציפי של RA

בשנת 2015 פרסמו Dasgupta וחב' ב-Am Coll Rheumatol את מחקרם בו בחנו את הספציפיות של קביעת רמת 14-3-3η במדגם שכלל מאובחנים עם RA בדרגות מתונות עד חמורות של המחלה כמו גם נבדקי ביקורת. המחקר כלל 147 נבדקים, מתוכם 36 חולי RA ו-111 נבדקי ביקורת בתוכם 20 עם אסתמה, 20 עם מחלת קרוהן, 16 עם פסוריאזיס, 20 עם sarcoid arthritis,‏ 23 עם spondylarthropathy ו-12 מתנדבים בריאים. מדידת 14-3-3η נעשתה בשיטת ELISA עם ערכת Augurex. אנליזה של עקומת ROC בוצעה לאשש את הספציפיות של 14-3-3η ל-RA.

תוצאות מחקר זה היו כדלקמן: הרמות החציוניות של 14-3-3η בנסיוב, היו משמעותית גבוהות יותר ב-RA (2.35 ננוגרם/מ"ל עם טווחי תוצאות של 0.28-19.41) בהשוואה לכל נבדקי הביקורת בהם נמצאה רמה אפסית של המדד האמור (p<0.0001). אנליזה של עקומת ROC חיזקה את המסקנה של ביטוי דיפרנציאלי של 14-3-3η ב-RA, כאשר התקבלה תוצאה עבור השטח-תחת-העקומה (AUC) של 0.86 (p<0.0001). עם ערך סף עליון של תחום הנורמה שנקבע כ-0.19 ננוגרם/מ"ל, עקומת ROC הניבה למדד זה רגישות של 81% וספציפיות של 84%. ניתוח על פי Kruskal-Wallis העלה שרמות 14-3-3η היו גבוהות משמעותית בחולי RA מאשר לכל המפגעים האחרים שנלמדו (p<0.0001). (תרשים למטה):

Asthma-A; CD-Crohn's disease; H-Healthy; PsO-Psoriasis; Rheumatoid Arthritis-RA; S-sarcoid arthritis; SpA-Spondylarthropathy

חלבון 14-3-3η בנסיוב יכול להבדיל בין osteoarthritis לבין inflammatory arthritis

בשנת 2015 פרסמו Naides וחב' ב-Ann Rheumat Dis מחקר שנועד להעריך את הספציפיות של 14-3-3η בקרב מטופלים עם קביעה רפואית של היותם לוקים ב-osteoarthritis (להלן OA). הסינוביום מפריש את החלבון המעודד-דלקת 14-3-3η לתוך הנוזל הסינוביאלי ולנסיוב, בחולים עם RA, ובמידה פחותה בחולים עם erosive psoriatic arthritis. מדידת חלבון זה בנסיוב היא בעלת רגישות של 64% באבחון RA בשלביו המוקדמים, ובעלת רגישות של 77% באבחון RA בשלביו המאוחרים והמבוססים. האבחנה המבדלת של RA מ-osteoarthritis, או זיהוי של ארתריטיס דלקתי יכול להיות קשה. במחקר זה שנערך ב- Quest Diagnostics השתתפו 166 רופאים הלוקים ב-OA, שנבדקו לרמת CRP ו-RF שלהם בשיטה נפלומטרית, נבחנו לרמתcyclic citrullinated protein (להלן CCP) בשיטת ELISA כמו גם מדידת 14-3-3η. תוצאות המחקר היו כדלקמן: מתוך 166 הרופאים המאובחנים עם OA שנבדקו במחקר זה, 11 (6.6%) נמצאו חיוביים ל-14-3-3η. עם זאת, רק ב-1 מתוך ה-11 החיוביים ל-14-3-3η נמצאה רמת CRP תקינה של 0.3 מיליגרם/דציליטר (נורמה של פחות מ-0.8 מיליגרם/דציליטר), רמת RF מוגברת של למעלה מ-123IU/ml (נורמה פחות מ-14IU/ml), רמת CCP מוגברת של למעלה מ-250U (נורמה פחות מ-20U) ורמת 14-3-3η של 1.9 ננוגרם/מ"ל (נורמה פחות מ-0.2 ננוגרם/מ"ל), ומקרה זה אמנם אובחן בדיעבד כ-RA. נבדק אחר בו רמות CRP, RF ו-CCP היו תקינות, ואילו רמת 14-3-3η שלו הייתה מאוד מוגברת (3.1 ננוגרם/מ"ל) אובחן בדיעבד כחולה ב-psoriatic arthritis בהתבסס על הנפיחות ב-2 אצבעות, כאבי מפרקים ושינויים בציפורני האצבעות, כל אלה בהיעדר פסוריאזיס קודמת. בנבדק שלישי שאובחן על ידי רופא כמקרה של OA, אך טופל בעבר כאילו הוא RA על ידי מתוטרקסאט ו-entanercept, נתקבלו התוצאות הבאות: CRP היה מוגבר (4.4 מיליגרם/דציליטר), RF היה מאוד מוגבר (מעל 1,200IU/ml), CCP היה מאוד מוגבר (מעל 250U), ו-14-3-3η היה גם כן מאוד מוגבר (מעל 20 ננוגרם/מ"ל).

אם לא מתחשבים בשלושת המקרים האחרונים עם אבחון של RA או של psoriatic arthritis, נמצא ש-8 מתוך 163 מקרים של OA נמצאו חיוביים ל-14-3-3η, המהווים 4.9%. הספציפיות של 14-3-3η כמדד של ארתריטיס דלקתית בקרב אלה עם OA נקבעה כ-95.1%. במחקר זה השכיחות הנמוכה של 14-3-3η מוגבר במדגם של מאובחנים עם OA, תומכת בספציפיות הגבוהה של מדד זה בחולי RA. יתרה מכך, 14-3-3η יכול לשמש בסיוע לזיהוי חולי RA או OA בקרב אלה מהנבדקים החשודים ל-OA.

בשנת 2014 פרסמו Maksymowych ו-Marotta ב-Clin Exp Rheumatol את תוצאות מחקרם על היתרון האבחוני של 14-3-3η בחולי RA. תוך מדידת רמת חלבון זה בשיטת ELISA, נמצא שקביעה יחידנית של 14-3-3η בחולי RA, היא בעלת רגישות של 63.6% וספציפיות של 92.6%, כאשר מתייחסים לערך cutoff של 0.19 ננוגרם/מ"ל. אך אם מוסיפים ערכי 14-3-3η במשולב עם בדיקת נוגדנים כנגד cyclic citrillinated peptide (להלן ACPA), התקבלו ערכי רגישות של 72% בהשוואה ל-59% עבור בדיקה יחידנית של ACPA. כאשר מוסיפים את תוצאת RF בהשוואה ל-59% של בדיקת ACPA, גדלה רגישות הבדיקה המשולבת ל-72%, והרגישות גדלה ל-78% כאשר מצרפים גם את נתוני בדיקת 14-3-3η.

תוצאה חיובית של סטאטוס 14-3-3η נמצאה כרוכה משמעותית עם הממצאים הרדיוגרפיים על התקדמות RA בשנים 1, 3 ו-5, מה שמצביע על שימושיות פרוגנוסטית של בדיקה זו. זיהוי רמות מוגברות של 14-3-3η או של נוגדנים עצמיים כנגד חלבון זה, הוכחה ב-90% מהנבדקים עם RA בשלביה המוקדמים.

בשנת 2014 פרסמו Maksymowych וחב' ב-J Rheumatol את תוצאות מחקרם שנועד לכּמת בשיטת ELISA את רמות 14-3-3η בתחלואה של RA לעומת אנשים בריאים. כמו כן נבחן במחקר זה הפוטנציאל האבחוני של 14-3-3η בהשוואה ל-RF ול-anti-cyclic citrullinated protein antibody. במדגם השתתפו 99 מטופלים בשלבי מחלה מוקדמים, 135 מטופלים עם RA ודאי, ו-385 אנשי קבוצת ביקורת מתוכם 189 אנשים בריאים. התוצאות היו כדלקמן: רמת14-3-3η בנסיוב, יכלה להבדיל בין מטופלים עם RA מבוסס, לבין נבדקים בריאים (p<0.0001). כאשר נבחר cutoff של 0.2 ננוגרם/מ"ל, רגישות השיטה והספציפיות שלה היו 77% ו-93%, בהתאמה, עם LR או likelihood ratio positivity של 10.4. ב-cutoff זה, 64% מנבדקים בשלבי RA מוקדמים נמצאו חיוביים ל-4-3-3η 1 עם ספציפיות של 93%, (ו-LR+ של 8.6), בעוד שרק 59% ו-57% נמצאו חיוביים ל- anti cyclic citrullinated protein antibody ול-RF, בהתאמה. כאשר החיוביות של RF, של anti cyclic citrullinated protein antibody ושל 14-3-3η נלקחו במשולב, 77 מתוך 99 מטופלים בשלבי מחלה מוקדמים המהווים 77%, נמצאו חיובים לכל אחד משלושת הסמנים. רמת 14-3-3η לא הייתה בהתאמה עם C-reactive protein, או עם ESR (קצב שקיעת הדם). לעומת זאת, רמה גבוהה של 14-3-3η הייתה בהתאמה לחומרת RA.

חלבון 14-3-3η ומחלת Creutzfeldt–Jakob

כמויות מוגברות של חלבוני 14-3-3 נמצאות בנוזל השדרה של מטופלים עם מחלת Creutzfeldt–Jakob (על פי Takahashi וחב' ב- Clin Diagnos Lab Immunol משנת 1999, ו-Steinacker וחב' ב- Sem Cell Develop Biol משנת 2011, Collins וחב' ב- J Clin Neurosci משנת 2000).

רמה ניתנת לגילוי של 14-3-3η ב-CSF היא אינדיקציה לדגנרציה נוירונית משמעותית ויחסית מהירה. רמות מוגברות של חלבוני 14-3-3 ב-CSF תוארו בנבדקים עם צורות שונות של מחלת Creutzfeldt-Jakob (להלן CJD) וגם במחלות מצבי שיטיון המתקדמים במהירות, אך גם במפגעים נוספים של מערכת העצבים המרכזית, בתוכם מפגעים וסקולאריים, דלקתיים, סרטניים ומטבוליים, בהם מתרחש הרס נוירוני מהיר. השימוש הקליני העיקרי של מדידת 14-3-3ηהיא לאבחנה מבדלת של שיטיון, ובעיקר להבדיל בין CJD והווריאנטים שלו מסוגי שיטיון אחרים. צורות שכיחות ביותר של שיטיון שאינן כרוכות עם רמות 14-3-3η מוגברות ב-CSF הן מחלת אלצהיימר ו- progressive multi-infarct dementia, כנראה בגין קצב ההתדרדרות האיטי שלהם.

האבחון של CJD מורכב ביותר וכרוך בהיסטוריה הקלינית, במבחן נוירולוגי, בבדיקת אלקטרו-אנצפלו-גרף (EEG) בבדיקת MRI, ובשלילת סיבות אפשריות אחרות לשיטיון, בנוסף לבדיקות CSF. רמת חלבון 14-3-3η ב-CSF השווה או גבוהה מ-1.5-2.0 ננוגרם/מ"ל, תומכת באבחון של CJD במטופלים עם קריטריונים אבחוניים נוספים המחשידים אבחון של מחלה זו. מדידת 14-3-3η ב-CSF מועילה במיוחד במקים של CJD ספוראדי, והיא מהווה אחת מפאנל רחב של מספר קריטריונים אבחוניים (Preissner וחב' ב-Clin Chem משנת 2009, ו-Castellani וחב' ב-Neurology משנת 2004).

קריטריונים אבחוניים של Sporadic CJD על פי הנחיות ה-WHO משנת 1998

  • Definitive CJD: אבחנה נוירו-פתולוגית על ידי טכניקה סטנדרטית, ו/או אימונו-היסטוכימיה, ו/או בדיקה בשיטת Western Blot לזיהוי חלבון prion עמיד לפרוטאזות, ו/או נוכחות של פיברילות הקשורות עם Scrapie
  • Probable CJD: שיטיון מתקדם; לפחות 2 מתוך התסמינים הבאים:
  • מיוקלונוס, אילמות אקינטית, פירמידאלית או חוץ-פירמידאלית, ויזואלית או צרבלארית
  • ממצא EEG חיובי כגון פּרִיקָה (discharge) מחזורית, אפילפטופורמית, ו/או ממצא חיובי של 14-3-3η ב-CSF, ומשך מחלה קצר משנתיים
  • היעדר לאבחנה חלופית
  • Possible CJD: שיטיון מתקדם; לפחות 2 מתוך התסמינים הבאים:
  • מיוקלונוס, אילמות אקינטית, פירמידאלית או חוץ-פירמידאלית, ויזואלית או צרבלארית
  • חסר ראיות תומכות בבדיקת EEG ומשך מחלה קצר משנתיים.

לא מוסכם עדיין תפקיד מבוסס למדידת 14-3-3η ב-CSF באבחון של מחלת CJD נרכשת או מוּלדת.

מגבלות טכניות של מדידת 14-3-3η ב-CSF: דגימות נוזל שדרה המוליטיות יש לפסול, שכן המוליזה גורמת לתוצאות מוגברות-כזובות של רמת 14-3-3η. בדיקות שנערכו ב-82 דגימות CSF "מוכתמות" בדם, הניבו תוצאות של רמות 14-3-3η שהגיעו עד 281 ננוגרם/מ"ל. ב-74 מתוך דגימות CSF אלו (90.2%) רמות החלבון הנמדד היו מעל ה-cutoff של 2 ננוגרם/מ"ל. בנוסף, דגימות CSF עלולות להיות מוגדרות כבלתי מתאימות לבדיקה האמורה, אם הם משקפות דימום מאקרוסקופי, אם הדגימות קסנתוכרומיות, אם ספירת הכדוריות האדומות ב-CSF היא מעל 500 כדוריות/מיקרוליטר, או אם ספירת הלויקוציטים ב-CSF היא מעל 10 לויקוציטים/מיקרוליטר.

ללא קשר לשיטת המדידה, קביעת רמת 14-3-3η ב-CSF אינה יכולה להוות ראייה קובעת בביסוס האבחון של CJD. רמות מוגברות ב-CSF של חלבון 14-3-3η, תוארו במגוון של מחלות מערכת העצבים המרכזית, פרט ל-CJD, שגם בהם יש הרס מהיר יחסית (ימים עד חודשים לעומת חודשים עד שנים) של כמויות משמעותיות של רקמה נוירונית. דוגמאות שפורסמו כוללות: infectious encephalitides, transverse myelitis, שבץ מוחי, שטף דם תוך-מוחי או תת-עכבישי (subarachnoid), שיטיון מהיר על רקע וסקולארי, אנצפאלופתיות על רקע מטבולי או אנוקסי, אפיזודות חריפות וחמורות של טרשת נפוצה ב-CNS, cerebral vasculitides ו-angiopathies, אנצפאלו-מיאלופתיות מיטוכונדריאליות ומחלות אגירה של ה-CNS. ב-RA סמנים אחדים יכולים להיות נוכחים במחלה כ-bystanders, בה בשעה שסמנים אחרים יכולים להיות קשורים באופן יותר אינטימי עם הפתוגנזה של המחלה.

רק מדידת 14-3-3η ב-CSF של Mayo Clinic היא בדיקה כמותית, כאשר כל הערכות הקיימות במדידה זו הן איכותיות או חצי-כמותיות מבוססות על Western Blots. עם זאת, הממצאים המתפרסמים בספרות הרפואית מצביעים על רגישות וספציפיות ברות-השוואה בין התוצאות המתקבלות בשיטת ELISA הנהוגה ב-Mayo Clinic לבין שיטת ה-Western Blot.

סך של 950 דגימות CSF כולל 14 דגימות של חולי CJD מוחלטים (בהיסטופתולוגיה שנעשתה לאחר המוות), נבחנו לרמת חלבון 14-3-3η. תוך שימוש בערך cutoff שנקבע מאנליזה של עקומת ROC, הרגישות של רמת 14-3-3η הייתה 78.6% והספציפיות של הבדיקה נקבעה כ-96.7%. זאת בהשוואה לבדיקת NSE (או neuron-specific enolase) אשר ב-cutoff של 43 ננוגרם/מ"ל, נקבעה לה רגישות של 78.6% וספציפיות של 94.0%. בקבוצה אחרת של 30 מקרים של CJD בדרגת ודאות ניכרת, אך ללא אישור היסטו-פתולוגי, NSE נמצא מוגבר ב-25 מהמקרים (83.3%), בעוד ש-14-3-3η נמצא מוגבר ב-21 מקרים (70.0%).

ב-235 דגימות CSF שנועדו לספירת אריתרומיטים ולויקוציטים, שלא נחשדו ל-CJD, נמצאו 13 דגימות עם ערכי 14-3-3η מוגברים, אך אלה נלקחו מנבדקים עם מפגעים אחרים בהם רמת ב-CSF ידועה כמוגברת כגון תסמונת Guillain-Barre ואנצפליטיס נגיפי.

הוראות לביצוע הבדיקה

אין צורך בהכנות מוקדמות או בצום של הנבדק. הדם נלקח במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב) ולאחר סירכוז והפרדת הנסיוב, ניתן לשמור אותו בקירור (יציב 7 ימים) או בהקפאה (יציב 3 שבועות). הבדיקה מתבצעת בשיטת ELISA. החלבון 14-3-3η ניתן לכימות בשיטת ELISA אפילו בריכוזים נמוכים שלו (van der Heijde וחב' בהרצאה בכינוס EULAR משנת 2012).

כאשר מדובר ב-CSF, לאחר נטילת 1 מ"ל של נוזל ב-LP, יש לשמרו בקרח. דגימות CSF שלא נשמרו בקירור באופן מוקפד, עלולות לתת תוצאות מוגברות-כזובות של 14-3-3η. גם דגימות CSF המוליטיות נותנות תוצאות מוגברות-כזובות, ויש לפסול אותן. דגימות CSF שנשמרו בקירור יציבות למשך 7 ימים, ואילו בהקפאה הן יציבות למשך 3 חודשים.

ראו גם