האיגוד הישראלי לרפואת משפחה

תרומבופויאטין - Thrombopoietin

מתוך ויקירפואה


הופניתם מהדף TPO לדף הנוכחי.

     מדריך בדיקות מעבדה      
תרומבופויאטין
Trombopoietin
 שמות אחרים  TPO וכן megakaryocyte growth and development factor או MGDF
מעבדה המטולוגיה בדם
תחום בירור הסיבה לתרומבוציטופניה מסיבה לא ברורה, כגון תרחיש של Idiopathic thrombocytopenia purpura או סיבה ל-immune thrombocytopenia, או לתסמונת מיאלו-דיספלסטית (MDS).
Covers bdikot.jpg
 
טווח ערכים תקין בנסיוב - 7-99 פיקוגרם/מ"ל
יוצר הערך פרופ' בן-עמי סלע

בסיס פיזיולוגי

תרומבופויאטין (להלן TPO) הוא גורם גדילה המווסת פיזיולוגית את יצירתם של טסיות-דם. TPO מעודד יצירה והתמיינות של מגקריוציטים, תאי מח העצם מהם נוצרות טסיות הדם (Kaushansky ב-N Eng J Med משנת 2006). הוא התגלה באופן בלתי-תלוי ונוקה בשנת 1994 על ידי מספר קבוצות (Lok וחב' ב-Nature ב-1994, וכן Bartley וחב' ב-Cell באותה שנה, ו-Kato וחב' ב-Biochem J משנת 1995). בנוסף לשם המקורי thrombopoietin שהוצע כבר שנת 1958 על ידי Kelemen וחב' ב-Acta Hematol משנת 1958 כמולקולה היפוטתית עשרות שנים לפני בידודה וזיהויה, חלבון זה זכה אף לשמות כמו megapoietin, כמו גם MGDF או megakaryocyte growth and development factor, וכן c-Mpl ligand לציון העובדה שהחלבון נקשר לקולטן שלו הידוע כ-c-Mpl (על פי Vigon וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1992).

בשנות המאה ה-20 המוקדמות, מחקריהם המקוריים של Carnot ושל Wright הצביעו לראשונה על התפקיד הקריטי של טסיות-דם בתהליך הקרישה, וכן על מקורם של תאים אלה מתאי האם שלהם, המגקריוציטים.

הגילוי והאפיון של MPLV או murine myeloproliferative leukemia virus, היה בעל השפעה על החיפוש אחר TPO. נגיף זה גורם לתסמונת מייאלו-פרוליפרטיבית חריפה בעכברים שהודבקו בו (Wendling וחב' ב-Virology משנת 1986). בשנת 1990 האונקוגן האחראי ל-MPLV שובט, והפרוטו-אונקוגן c-mpl הקרוי כיום Mpl שובט שנתיים מאוחר יותר (Souyri וחב' ב-Cell משנת 1990 ו-Vigon וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1992). בהתבסס על הנוכחות של 4 שיירי ציסטאין מרחביים שהשתמרו ורצף של פנטפפטיד סמוך לממברנה (Trp-Ser-Naa-Trp-Ser), היה מייד ברור ש-c-mpl מקודד לחבר במשפחת הקולטנים לציטוקינים הֶמָאטוֹ-פויאטיים, הכוללת את הקולטנים ל-EPO, ל-IL-3, ל-GCSF או granulocyte colony-stimulating factor, ל-GM-CSF או granulocyte- macrophage colony-stimulating factor, ל-IL-11, IL-9, IL-7 ,IL-5, כמו גם ללימפוקינים נוספים (Cosman ב-Cytokine משנת 1993). יחד עם זאת, כאשר הגן לקולטן ל-TPO שובט בשנת 1992, לא היה ידוע טבעו של הליגנד הנקשר לקולטן זה. בהתבסס על סוג התא אשר ממנו שובט c-mpl, שהיא שורת התאים האריתרואידית/מגקריוציטית HEL שהיא דו-תכליתית, העריכו Long וחב' ב-J Clin Invest משנת 1990, שהליגנד ל-c-Mpl עשוי להיות TPO.

כאשר Vigon וקבוצתו שיבטו את c-Mpl לכל אורכו, הם מצאו שה-mRNA שלו נמצא בכמויות משמעותיות בטסיות דם ובמגקריציטים, וכן באחוז קטן של תאי +CD34, שהם קודמנים מוקדמים של תאים המאטו-פויטאטיים (Debili וחב' ב-Blood משנת 1995). הזיהוי של c-Mpl כקולטן של TPO, זכה לתמיכה על ידי ההדגמה שפחתה יצירתם של מגקריוציטים, אך לא זו של תאים מייאלואידים או אריתרואידים, על ידי precursors במח העצם, כאשר הסינתזה של c-Mpl עוכבה על ידי הוספה של אלמנטים של c-Mpl antisense (עפ"י Methia ב-Blood משנת 1993).

הגן של TPO

בשנת 1994 פורסם ב-FEBS Lett לראשונה על ידי Sohma וחב' השיבוט המלא של הגן המקודד ל-TPO, גן זה שאורכו 6.2kb, מכיל 7 exons ו-5 introns, כאשר שני ה-exons הראשונים הם noncoding. ה-exon השלישי מכיל חלק של ה-'5 untranslated sequence וחלק מה-signal peptide. אקסונים 4-7 מקודדים את חלקו של TPO שהוא דמוי-אריתרופויאטין, ואילו כל המקטע של TPO המכיל את רצף חומצות האמינו 155 עד 332 עם כל ששת השרשרות הסוכריות מקודד על ידי exon 7. הגנום האנושי מכיל עותק אחד של הגן ש TPO מה שנקבע באנליזת Southern blotting. הגן של TPO מופה על כרומוזום 3q27-28, על ידי היברידיזציה in situ תוך שימוש ב-probe מסומן עם ביוטין.

המבנה של TPO

באמצע שנות ה-60, מספר קבוצות ניסו לנקות TPO מפלזמה של בעלי-חיים תרומבוציטופניים. ניסיונות אלה סבלו ממגבלות של בדיקות מורכבות ואף לא רגישות לבחון את פעילות ההורמון, ולכן הם נכשלו אפילו בשאלה הבסיסית של קיומו-אם בכלל-של TPO. בשנות ה-80 החלו להיות זמינים מבדקים in vitro לבחינת ההתמיינות (differentiation) של מגקריוציטים, ואז החל מחזור נוסף של ניסויים לניקוי ואפיון של TPO, אך עדיין נכשלו הניסיונות לבודד cDNA של-TPO, תנאי בל יעבור להוכחת מציאותו של חלבון.

TPO מיוצר בעיקר על ידי תאי פרנכימה בכבד, כאשר כמויות קטנות בהרבה מיוצרות בכליות ובמח העצם (Nomura וחב' ב-Exp Hematol בשנת 1997). חלבון זה מסונתז כקודמן (precursor) של 353 חומצות אמינו, עם משקל מולקולארי של 36,000 דלטון (Foster וחב' ב-Proc Natl Adad Sci USA משנת 1994. לאחר הסרה של 21 חומצות אמינו של ה-signal peptide (הידוע גם כ-secretory leader sequence), עובר הפפטיד הנותר עם 332 חומצות אמינו, תהליכי גליקוזילציה ליצירה של גליקופרוטאין בעל משקל מולקולארי של 95,000 דלטון, המופרש לצירקולציה ללא כל אגירה בכבד או בכליות. כאשר מוערך משקלו המולקולארי של TPO בשיטה מס-ספקטרומטרית משקלו המולקולארי נקבע כ-57,500 דלטון (עפ"י Hoffman וחב' ב-Biochemustry משנת 1996).

מבנה דו-ממדי של thrombopoietin

TPO הוא גורם גדילה המטופויאטי בלתי רגיל במספר היבטים: הוא הרבה יותר גדול מרוב החלבונים האחרים המווסתים של יצירת תאי-דם, כגון erythropoietin או granulocyte colony-stimulating factor הידוע כ-G-CSF.

לרצף של 153 חומצות אמינו הראשונות בקצה ה-N טרמינאלי של TPO בשל, יש הומולוגיה מוחלטת של 23% עם erythropoietin של אדם (Gurney וחב' ב-Blood משנת 1995), וכן 46% דמיון לאריתרפויאטין של אדם. אזור זה מכיל 4 שיירי ציסטאין והוא השתמר מאוד גם ב-EPO של בעלי חיים אחרים, אך למרות קווי דמיון אלה TPO אינו נקשר לקולטן של EPO, באותה מידה ש-EPO אינו נקשר לקולטן של TPO (עפ"י Broudy וחב' ב-Blood משנת 1997).

עוד מאפיין של TPO שרצף חומצות האמינו 154 עד 332 מכיל 6 אתרי גליקוזילציה (N-linked), ורצף זה פחות משומר בין המינים השונים. ואמנם לרצף של 176 חומצות האמינו ה-C טרמינאליות אין הומולוגיה עם איזשהו חלבון ידוע. מחקרים על הקשר בין מבנה ופקוד פיזיולוגי הדגימו ש-153 חומצות האמינו הראשונות של TPO, הן היחידות הנדרשות להשפעתו התרומבו-פויאטית in vitro (על פי de Sauvage וחב' ב-Nature משנת 1994), שכן מקטע N-טרמינאלי זה הוא שנקשר לקולטן c-Mpl (עפ"י Kuter וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1994). אך אם מבקעים את TPO בין חומצות אמינו Arg153 ו-Arg154, מסתבר שמחצית אורך החיים של הפפטיד המכיל את 153 חומצות האמינו בהזרקתו לציקולציה, קצר בהרבה מזמן מחצית החיים של 20-40 שעות של חלבון TPO השלם (Hokom וחב' ב-Blood משנת 1995 ו-Harker וחב' ב-Blood משנת 1996). סבורים שהמחצית השנייה המכילה 6 שרשרות סוכר מחומצת אמינו 154 ואילך בחלבון השלם, מקנה יציבות ומאריכה את תקופת מחצית החיים (עפ"י Vadhan-Raj ב-Semin Hematol משנת 1998). תופעה דומה מוכרת גם עם EPO. המבנה הגבישי של TPO נלמד והוא מגלה אגד המורכב מ-4 גדילים (helixes) אנטי-מקבילים דומים לאלה של EPO , שבקיפולם יוצרים 2 אתרי קישור שונים בעלי זיקות שונות לקולטן של TPO. אתר קישור אחד הוא בעל קבוע קישור של 3.3nM והשני בעל זיקה נמוכה יותר עם קבוע קישור של 1.1nM (על פי Feese וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2004).

נמצא ששיירי החלבון TPO החיוניים לקשירתו לקולטן c-Mpl ממוקמים בגדילי α-helix הראשון והרביעי, וכן למקטע המחבר את ה-helices הראשון והשני (על פי Pearce וחב' ב-J Biol Chem משנת 1997). כתוצאה מכך, שיירים ספציפיים ב- A Helix של החלבון האחראיים לקישור לקולטן הם Lys14, Arg10 ו-Arg17, והשיירים הספציפיים לקישור זה ב- D helix הם Lys138, Gln132, His133 ו-Phe141. במשפחה עם תרומבוציטופניה מוּלֶדֶת ואנמיה אפּלסטית גילו Dasouki וחב' (Blood משנת 2013) מוטציה נקודתית Arg17Cys, בו שייר ציסטאין שִחלף את הארגינין בעמדה 17 של A helix, מה שמפריע כנראה לקישור ה-TPO הפגום לקולטן.

התפקיד של הקטע ה-C טרמינאלי ב-TPO העשיר בסוכרים, פחות ברור. קטע זה אינו חיוני לקישור לקולטן, וכאמור קטע זה השתמר פחות אבולוציונית בין בעלי החיים השונים. TPO של אדם ועכבר זהים ביניהם בשיעור של 62% בלבד ברצף של הקטע ה-C טרמינאלי, בה בשעה שהקטע ה-N טרמינאלי נטול הסוכרים ודמוי-EPO, נרשמה זהות של 84% ברצף חומצות האמינו בין אדם ועכבר. באופן פרדוקסאלי נמצא שמולקולת TPO קטומה (truncated) היא בעלת פעילות ספציפית גבוהה פי-20 מזו של המולקולה השלמה (Foster וחב' ב-Stem Cells משנת 1996).

תפקיד נוסף לחלק ה-C טרמינאלי של TPO בכך שהוא משמש כ-chaperone תוך-מולקולארי, בעזרה להתכנסות (folding) התלת-ממדית הנכונה ליצירת ההורמון הבוגר (על פי Linden ו-Kaushansky ב-J Biol Chem משנת 2002, ו-Muto וחב' באותו כתב עת משנת 2000).

ניסויים קליניים עם TPO

בשנת 1994 החלו ניסויים קליניים עם 2 צורות של TPO רקומביננטי: האחד, rhTPO, או TPO אנושי רקומביננטי, הוא החלבון TPO באורכו המלא. האחר, שהוא TPO קטום (truncated) המכיל רק 163 חומצות אמינו של הקטע ה-N טרמינאלי הנקשר לקולטן, שעבר שינוי כימי על ידי הוספה של PEG או polyethylenglycol בעזרת אלקילציה מחזרת. רקומביננט-PEG זה מכונה גם PEG-conjugated recombinant human megakaryocyte growth and development factor או PEG-rhMGDF. שני תוצרים אלה הם בעלי פעילות ביולוגית ניכרת בגירוי גדילתם של מגקריוציטים, באדם ובבעלי חיים.

מספר ניסויים קליניים הראו עלייה במספר טסיות הדם במגוון של תרחישים קליניים החל מתרומבוציטופניה מושרית על ידי כימותרפיה (Fanucci וחב' ב-N En J Med משנת 1997), וכלה ב-Immune thrombocytopenia או ITP (על פי Nomura וחב' ב-Blood משנת 2002). לרוע המזל, נוגדנים שנוצרו כנגד PEG-rhMGDF במספר מתנדבים בריאים שקיבלו תכשיר זה, לא רק שנטרלו את פעילותו של ריקומביננט זה, אלא אף הגיבו ונטרלו את הפעילות של TPO אנדוגני עד כדי הופעה פרדוקסאלית של תרומבוציטופניה (Lee וחב' ב-Blood משנת 2001). ממצא זה עורר דאגה בדבר האימוּנוגניוּת הבלתי רצויה של התכשיר, ולהפסקת המשך הפיתוח של TPOs ריקומביננטיים.

אך התוצאות המבטיחות של הניסויים הקליניים המוקדמים עם TPOs ריקומביננטיים, הביאו לפיתוחם של מספר תכשירים תרומבופויאטינים מהדור השני, שההתייחסות אליהם היא כאל אגוניסטים של הקולטן של TPO (על פי Kuter ב-Blood משנת 2007 וב-Ann Rev Med משנת 2009). תכשירים אחרונים אלה היו גריינים יעילים של גדילת מגקריוציטים ויצירת TPO. שניים מאגוניסטים אלה, romiplostim ו-eltrobopag, אושרו במדינות רבות לשימוש לטיפול ב-ITP (עפ"י Imbach ו-Growther ב-N Eng J Med משנת 2011, ו-Jenkins וחב' ב-Blood משנת 2007). נראה ש-TPO יכול גם להיקשר לקולטן c-Mpl על פני טסיות-דם (Li וחב' ב-Br J Hematol משנת 1999 ו-Broudy וחב' ב-Blood משנת 1997). באותו הקשר כדאי לציין שבדומה ל-TPO, גם האגוניסט romiplostim, נקשר למקטע הדיסטאלי CRH-2 של הקולטן, בעוד שהאגוניסט האחר, eltrombopag, נקשר למקטע CRH-2 של הקולטן.


שפעול של הקולטן ל-TPO על ידי TPO או על ידי אגוניסטים לקולטן. TPO ו-romiplostim נקשרים ל-CRH-2 או cytokine receptor homology domain הדיסטאלי של דימר הקולטן במצבו הלא פעיל. Eltrombopag נקשר למקטע הטרנס-ממברנאלי של הקולטן.


המבנה של romiplostim: לכל זרוע של השרשרת הכבדה של IgG מוחדרים 2 פפטידים זהים בני 14 חומצות אמינו עם הרצף IEGPTLRQWLAARA, דרכם נקשר התכשיר לקולטן של TPO.


בשנת 2006 דיווחו Nakamura וחב' ב-Blood על תכשיר לא פפטידי, NIP-004, כבעל פעילות אגוניסטית על הקולטן ל-TPO.


המבנה של NIP-004

הקולטן של TPO

כיום ידוע שהקולטן ל-TPO נמצא על פני טסיות-דם ומגקריוציטים, וכמות קטנה יותר על פני רוב תאי הקודמן ההמאטו-פויאטיים. מחקרים עם טסיות-דם באדם מצביעים על נוכחות של 56±17 קולטנים ל-TPO לכל תא של טסיות-דם, עם זיקה של 163±31 פיקומול' לליטר (Li וחב' ב-Br J Hematol משנת 1999).

מספר אזורים בקולטן c-Mpl זוהו כחיוניים להעברת איתותים לתוך התא. חיתוך פרוטאוליטי של הקולטן במרחק של 69 שיירים של חומצות אמינו מהמקטע הטרנס-ממברנאלי, מבטל את יכולתו לשפעל את Shc ואת STAT3, אך הקולטן הקטום עדיין יכול להעביר מסרים ולקדם שגשג תאים עם שפעול מופחת של STAT5 ,PI3K ו-ERK1/2 (עפ"י Alexander וחב' ב-EMBO J משנת 1996). נמצא גם שסטימולציה על ידי TPO גורמת לתהליך מהיר של החדרה (internalization) של הקולטן c-Mpl אך תוך התא ופירוקו בליזוזום. מסתבר ש-adaptor protein-2 או AP2 נקשר ל-motif התוך-תאי Y591BRL, מה שמגרה יצירה של clathrin ואנדוציטוזה, כאשר Y591BRL מוביל את הקולטן לליזוזום (עפ"י Hitchcock וחב' ב-Blood משנת 2008).

פרט לתהליך ההחדרה וההריסה של c-Mpl בליזוזום, הקולטן המשופעל של TPO עובר גם תהליך של ubiqutination על ידי סימונו כמיועד להשמדה בחלקיק ה-proteasome. סימון ה-ubiqutination מתבצע במקטע התוך-תאי של הקולטן, בשני שיירי ליזין, K553 ו-K573 (עפ"י Li וחב' ב-Br J Hematol משנת 1999 ו-Fiedler וחב' ב-Blood משנת 1996). בשנת 2010 הראו Saur וחב' ב-Blood שאחר החדרתו לתא אין כל אפשרות שהקולטן ל-TPO יתבטא שוב על פני תאי טסיות הדם.

בחיות טרנסגניות, בהן קיים חסר בייצור TPO או יש פגם בקולטן שלו, מספר תאי Meg-CFC או Megakaryocyte colony forming cells, פוחת כצפוי ב-90-95%, ומספר תאי הקודמן של השורה המייאלואידית והאריתרואידית פוחת ב-60-89% (עפ"י Alexander וחב' ו-Carver-Moore וחב', שניהם ב-Blood משנת 1996). יחד עם זאת, הספירה הנורמאלית של נויטרופילים ואריתרוציטים בחיות אלו, נשמרת כנראה על ידי מנגנוני feedback הנתמכים על ידי G-CSF ו-EPO, בהתאמה.

המנגנון דרכו נקשר TPO לקולטן שלו ומאתחל את העברת האיתותים התוך-תאיים נלמד היטב. בדומה לקולטן של EPO (עפ"י Remy וחב' ו-Livnah וחב' בשני מאמרים צמודים שהתפרסמו ב-Science ב-1989), גם הקולטן לTPO (או c-Mpl) קיים כקולטן בלתי-פעיל שהוא dimer המורכב מ-2 מונומרים זהים שכל אחד מהם מורכב מ-2 מקטעים (domains) הידועים כ-CRH או cytokine receptor homology: אחד משני מקטעים אלה, CRH-1, חוצה את ממברנת התא לכל רוחבה כאשר חלקו הדיסטאלי נמצא מחוץ לתא, וחלקו הפרוקסימאלי נתון בתוך ציטופלזמת התא; המקטע האחר, CRH-2, כולו דיסטאלי ומשתרבב אל מחוץ לממברנת התא.

TPO נקשר אך ורק למקטע CRH-2 הדיסטאלי, מה שגורם לדימריזציה של הקולטן ולשפעולו, וכן להפעלה של מגוון רחב של מסלולי העברת איתותים, שהידועים ביותר מתוכם הם מסלולי JAK ו-STAT, שעוברים תהליכי זִרחוּן ומעודדים שגשוג תאים (עפ"י Drachman וחב' ב-J Biol Chem משנת 1995). בנוסף, יש גם שפעול של מסלול של האנזים MAPK או mitogen-activated protein kinase הספציפי לחומצות אמינו serine, threonine ו-tyrosine. השפעול של MAPK גורם בין השאר לתהליך הבשלת התא. כמו כן, הקישור של TPO לקולטנו גורם לשפעולם של מסלולים בתוך תא המגקריוציט המונעים אפופטוזיס (עפ"י Baker וחב' ב-Cardiovasc Res משנת 2008, Borge וחב' ב-Blood משנת 1996 ו-Zauli וחב' ב-Blood משנת 1997), המשפרים את חיות התא, מעודדים את שגשוגו, וכנראה מגבירים את יכולת ההתמיינות (differentiation) שלו (Kaushansky ב-Blood משנת 1995).

יתרה מכך, הוספה של TPO לתאי +CD34 בתרבית, הביא אחוז ניכר מתאים אלה להפוך למגקריוציטים, ולהשתחררות של טסיות דם מתאים אלה (Choi וחב' ב-Blood משנת 1995). שלב אחרון זה של השתחררות טסיות דם ממגקריוציטים אינו דורש ואף אינו מעוכב על ידי נוכחות של TPO (עפ"י Choi וחב' ב-Br J Hematol משנת 1996).

הקולטן של TPO נמצא במגוון גדול של רקמות הֶמאטוֹ-פּויֶאטיוֹת החל מתאי גזע עד ל-Meg-CFC או Megakaryocyte colony stimulating cells, לתאי גזע בוגרים או פרוגניטורים של שורת התאים האריתרואידית או המייאלואידית, למגקריוציטים צעירים או מאוחרים ולטסיות-דם בשלות. קולטנים ל-TPO אינם נמצאים ברקמות נורמאליות או סרטניות שאינן המאטו-פויאטיות (Columbyova וחב' ב-Cancer Res משנת 1995), אם כי ייתכן שהם נמצאים במיוציטים של הלב (Baker וחב' ב-Cardiovasc Res משנת 2008, ובנוירונים, מיקרוגליה ואסטרוציטים במוח (Zhang וחב' ב-J Interferon Cytokine Res משנת 2010).

הפיזיולוגיה של TPO

רבות נלמד על השפעותיו של TPO על מגקריוציטים, טסיות-דם ותאי-אב במח העצם, ועל הוויסות של רמתו בדם (Kaushansky ב-N Eng J Med משנת 2006ו-Kuter ב-Br J Hematol משנת 2014). נמצא ש-TPO הוא המווסת הרלוונטי המשפיע ביותר על קצב יצירת מגקריוציטים וטסיות-דם. בעכברי knock-outבהם נוטרלו 2 העותקים של הגן ל-TPO, מסת המגקריוציטים וטסיות הדם פחתה לכדי 10% מרמתם הנורמאלית, אך יחד עם זאת עכברים אלה נותרים בריאים ואינם מדממים באופן ספונטאני וספירת האריתרוציטים והנויטרופילים בהם תקינה (Alexander וחב' ב-Blood משנת 1996, ו-de Sauvage וחב' ב-J Exp Med משנת 1996).

בעכברים בהם נוטרל רק עותק אחד של שני הגנים המקודדים ל-TPO, ספירת טסיות הדם ירדה כדי 50-65% מהספירה התקינה. עכברים אלה עם רמת TPO מופחתת, יכולים להגביר את ייצור טסיות הדם כאשר מטפלים בהם בגורמי-גדילה המעודדים TPO כגון הציטוקינים IL-11, IL-6 וכן stem cell factorהידוע גם כ-c-kit ligand (עפ"י Carver-Moore וחב' ב-Blood משנת 1996). יחד עם זאת, נראה שאף לא אחד מ-2 הציטוקינים IL-6 ו-IL-11 הוא בעל אחריות לפעילות השארית של TPO באותם עכברי knock-out. באותו הֶקשר כדאי לציין שעכברי knock-out בהם נוטרלו שני העותקים של הגן המקודד לקולטן של TPO, הם תרומבוציטופניים, אך עכברים בהם רק עותק של גן זה נוטרל, מראים ספירה תקינה של טסיות דם (Gurney וחב' ב-Science משנת 1994).

כדאי להתייחס להשפעה של מתן יום-יומי של רקומביננט של TPO לקופי באבון נורמאלים: במשך 4 הימים הראשונים של מתן rTPO, אין שינוי בספירת טסיות הדם, אך ביום החמישי מתחילה ספירה זו לעלות ומגיעה לשיאה 8-12 יום מתחילת הטיפול, כאשר עלייה זו תלויה בכמות rTPO המוזרקת. בניסוי זה ניתן היה להשיג עליה מרשימה של עד פי-6 בספירת טסיות הדם, וכאשר הופסק הטיפול חזרה ספירת הטסיות לרמתה הקודמת תוך 10 ימים (Harker וחב' ב-Blood משנת 1996). תוצאות דומות מבחינת השפעה ולוחות הזמנים הושגו על ידי טיפול עם rTPO במתנדבים בריאים (Kuter וחב' ב-Blood משנת 2001) או בחולי סרטן מתקדם (Basser וחב' ב-Lancet משנת 1996), ללא כל השפעות רעלניות של ריכוזי TPO גבוהים. לא נמצאה בבני האדם המטופלים ב-TPO כל השפעה על ספירת אריתרוציטים או לויקוציטים.

השפעת TPO על תפקוד טסיות-דם

בנוסף להגדלה של מספרם של מגקריוציטים וטסיות דם, TPO יכול גם להשפיע על תפקודן של טסיות הדם. כאשר TPO נקשר לקולטן שלו על טסיות-דם, הוא משרה את הזרחון של טירוזין בקולטן c-Mpl ובמספר חלבונים אחרים במספר מסלולים של העברת איתותים תוך-תאיים (עפ"י Chen וחב' ב-Blood משנת 1995, כמו גם Kubota וחב' ב-Stem Cells משנת 1996 ו-Montrucchio וחב' ב-Blood משנת 1996). למרות ש-TPO אינו גורם ישירות לשפעול של טסיות, הוא מוריד ב-50% את סף השפעול של תאים אלה על ידי אגוניסטים אחרים של טסיות כגון ADP וקולאגן.

כמויות על-פיזיולוגיות של TPO שמעל 100 ננוגרם/מ"ל, מסוגלות לשפעל ישירות צימות (אגרגציה) של טסיות-דם in-vitro (עפ"י Akkerman ב-Semin Thrombosis & Hemostasis משנת 2002), בעוד שריכוזים פיזיולוגיים של TPO גורמים ל-priming של טסיות דם ולגירוי שלהם על ידי אגוניסטים אחרים, כנראה על הגברת הפעילות של Ras (עפ"י van Willigen וחב' ב-Thromb Hemostas משנת 2000). ל-TPO יש גם השפעה על יכולת הספיחה של טסיות-דם, ואף בריכוזים נמוכים (0.01-0.1 ננוגרם/מ"ל) מגביר TPO את ספיחת TPO לגורם von Willeband ומונע את תלישת TPO מ-vWF אף בכוחות גזירה גבוהים, מה שמצביע על כך ש-TPO עשוי להיות חיוני ביצירת קרישי הדם (Van Os וחב' ב-Br J Hematol משנת 2003).

השפעת TPO על תאי-מח עצם

למרות ש-TPO משפיע על על אירועים מאוחרים יחסית של הבשלה תאית רק במגקריוציטים, נראה ש-TPO והקולטן שלו (c-Mpl) מסתמנים כבעלי תפקיד חשוב בוויסות גדילתם של תאים קודמנים (precursors) של שורות תאים (lineages) אחרים ואפילו של תאי גזע רב-פוטנציאליים (pluripotential stem cells) של השורה האריתרואידית והגרנונולוציטית (על פי Kaushansky וחב' ב-Exp Hematol משנת 1996, וכן ב-Blood משנת 1998, כמו גם Solar וחב' ב-Blood משנת 1998). רוב הראיות מצביעות על כך שקישור TPO לקולטניו מגבירים את ההישרדות ואת יכולת השגשוג של תאי קודמן שכבר עברו מחויבוּת, אך השפעתם פחותה על תאי גזע בראשית דרכם.

יחד עם זאת TPO חיוני לחיוּת של תאי גזע, וילדים וחיות מעבדה שנולדו ללא TPO או ללא הקולטן ל-TPO הם תרומבוציטופנים מלידה, ומפתחים במרוצת הזמן pancytopenia (על פי Ballmaier וחב' ב-Blood משנת 2001). אמנם, מטופלים שפיתחו נוגדנים כנגד TPO בסופו של דבר מפתחים pancytopenia (עפ"י Basser וחב' ב-Blood משנת 2002 ו-Kaushansky וחב' ב-J Clin Invest משנת 1995).

מנגנון הפעולה המולקולארי של TPO

הקולטן c-Mpl הוא חבר במשפחת קולטנים הידועה כ-type I cytokine receptors , ביחד עם הקולטנים של מספר interleukins, מספר CSFs או colony stimulating factors, וכן של EPO. בדומה לקולטנים של גורמי גדילה רבים, קישור של ליגנדים לקולטניהם משרה זרחון של הקולטן ושל חלבונים הכרוכים עם הקולטן, מהווה חלק אינטגראלי של התגובה התאית לפעילות ההמאטו-פויאטית של הציטוקין (Tojo וחב' ב-Exp Cell Res משנת 1987 ו-Satoh וחב' ב-J Biol Chem משנת 1992). יחד עם זאת, בדומה לקולטנים אחרים באותה משפחת קולטנים, גם c-Mpl חסר פעילות קינאזה עצמית, ובמקום זאת הוא מגייס קינאזות ציטופלזמטיות ונכרך ישירות עם פעילותן, על מנת לתווך בשפעול של חלבונים מאותתים במסלולים הציטופלזמיים שלהם (downstream signalling proteins).

כיום ידוע שהשלבים הראשונים של זרחון קולטני משפחה זו לאחר התקשרות הליגנד, והשריית האיתותים התוך-תאיים תלויים בפעילות קינאזות Janus או JAKs. האנזים JAK2 נקשר ל-c-Mpl, והקומפלקס c-Mpl/JAK2 מייצב את פעילות הקולטן, ומגביר את הנוכחות של c-Mpl בממברנה (Tong וחב' ב-J Biol Chem משנת 2006).

מחקר אינטנסיבי מתחילת שנות ה-90 תוך שימוש בשורות תאים המבטאים את הקולטן c-Mpl, הביא לזיהוי של חלבונים שונים המשופעלים על ידי פעילות TPO. כיוון שיש דמיון יחסית קרוב בין קולטן זה לבין הקולטן לאריתרופויאטין (EpoR), המחקרים המוקדמים התמקדו במסלול JAK/STAT, וזיהו את JAK2 ואת TYK2 כשתי הקינאזות המיידיות הנקשרות ל-c-Mpl לאחר שפעולן לאחר קישור TPO לקולטנו (עפ"י Bacon וחב' ב-FEBS lett משנת 1995 ו-Drachman ב-J Biol Chem מאותה שנה), מה שמוביל לשפעול של STAT3 ו-STAT5 (עפ"י Drachman ו-Kaushansky ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1997).

גירוי על ידי TPO גורם לזרחון וליצירה של הקומפלקס Shc-Grb2-SOS (עפ"י Hill וחב' ב-Cell Growth Differentiation משנת 1996), כמו גם לשפעול של 2 אנזימי הפוספאטאזה SHIP ו-SHPTP-2, ולסטימולציה של שני המסלולים, phosphoinositide-3/kinase AKT (עפ"י Miyakawa וחב' ב-J Biol Chem משנת 2001), ומסלול Raf-1/MAP kinase (עפ"י Yamada וחב' ב-Bichem Biophys Res Commun משנת 1995).

הוויסות של רמת TPO בדם

היצירה של TPO בכבד היא קונסטיטוטיבית, כאשר רמות ההורמון נקבעות על ידי מספר טסיות הדם בצירקולציה. בניגוד ליצירת תאי דם אדומים, המושפעת ממערכת המזהה תרחישי היפוקסיה, ומסוגלת לשנות את קצב השעתוק (transcription) של הגן ל-EPO, אין מערכת כזו המשפיעה על ספירת TPO בצירקולציה (עפ"י Kuter ו-Rosenberg ב-Blood משנת 1995). ה-mRNA של TPO מיוצר באותו קצב באנשים בריאים ובאלה עם תרומבוציטופניה, אך הוא מופחת באנשים עם מחלת כבד (Stoffel וחב' ב-Blood משנת 1996). האופי הקונסטיטוטיבי של יצירת TPO אותגר על ידי מחקרים בעכברים בהם הראו שהקולטן של Ashwell-Morell על פני הפאטוציטים, קשר טסיות-דם מזדקנות שאבדו חומצה סיאלית כסוכר קצה. במצב של זה העלמת טסיות מזדקנות אלו, נמצא שיש שפעול של מסלול האיתות JAK-STAT מה שהגביר את יצירת mRNA של TPO בכבד ויצירה מוגברת של TPO במערכת-מודל זו (עפ"י Gozovsky וחב' ב-Nature Medicine משנת 2015). לא ברור האם נתון זה רלוונטי גם בבני-אדם.

ישנם מספר ספקות לגבי המודל האחרון המוצע על ידי Grazovsky בעכברים: א) אם הרחקת טסיות על ידי הקולטן של Ashwell-Morell מגבירה יצירת TPO, כי אז במטופלים עם תרומבוציטופניה חמורה (כמו לדוגמה באנמיה אפלסטית), רמת היצירה של TPO ורמת ההורמון בדם הייתה צריכה להיות נמוכה, כאשר למעשה רמה זו עולה בצורה ניכרת. ב) בתרחישים של פינוי מוגבר של טסיות-דם (כגון ב-ITP). המנגנון של קולטני Ashwell-Morell היה צריך לכאורה לגרום ליצירה מוגברת ולרמה מוגברת של TPO, כאשר למעשה רמות TPO בתרחיש זה נורמאליות או אף נמוכות. ג) כאשר TPO נוצר, רמותיו בצירקולציה מווסתות על ידי הרמה הכוללת של טסיות-דם. מגקריוציטים וטסיות-דם, המכילים קולטנים בזיקה גבוהה ל-TPO, וקושרים ומפנים TPO מהצירקולציה, ועל ידי כך קובעים את רמת TPO (עפ"י Lee וחב' ב-Br J Hematol משנת 1999). הראיות לכך הן כדלקמן: כאשר יצירת טסיות פוחתת כמו בתרומבוציטפניה כתוצאה מהיפופלזיה של מגקריוציטים, פוחת הפינוי של TPO ורמתו עולה בדם. כמו כן, רמות TPO בדם פוחתות לאחר עירוי של טסיות דם (Scheding וחב' ב-Transfusion משנת 2002).

מפגעים של TPO ושל הקולטן שלו

הבנת הפיזיולוגיה של TPO מסייעת בניתוח של מספר מפגעים קליניים החל מעודף יצירת TPO וכלה בביטוי מופחת של הקולטנים שלו. באחוז גבוה מהאנשים עם תרומבוציטופניה או עם תרומוציטוזה מתגלות מוטציות בגן ל-TPO או בגן ל-c-Mpl.

  • תרומבוציטמיה משפחתית או תרומבוציטוזה מורשת: הוא מפגע נדיר המועבר בהורשה אוטוזומאלית שולטנית. מפגע זה נובע משפעול של מוטציות בגנים ל-TPO או ל-c-Mpl, או אף ממוטציות בגנים של חלבונים אחרים (עפ"י Wiestner וחב' ב-Br J Hematol משנת 2000 וב-Nat Genet משנת 1998). מוטציות אלה אינן מעורבות במקרים השכיחים יחסית של essential thrombocytemia.
  • תרומבוציטופניה מולדת על רקע חסר במגקריוציטים (Congenital amegakaryocytic thrombocytopenia): הוא מפגע נדיר המאופיין על ידי תרומבוציטופניה חמורה והעדר מגקריוציטים במח העצם. חלק מהמאובחנים עם מפגע זה, הם הומוזיגוטים למוטציות הפוגעות בתפקוד הקולטן c-Mpl.
  • תרומבוציטופניה נרכשת על רקע חסר במגקריוציטים (Acquired amegakaryocytic thrombocytopenia): הוא מפגע נדיר כתוצאה מיצירת נוגדנים עצמיים המכוונים כנגד הקולטן c-Mpl, המדווחת לעתים שכיחות המטופלים עם SLE. דווחו גם מקרים של הופעת נוגדנים כנגד TPO.
  • כשל של הכבד: כיוון שהכבד הוא האיבר העיקרי ליצירת TPO, והגן המקודד ל-TPO אינו ניתן להשפעה אינדוקטיבית, חסר TPO הוא האחראי לתרומבוציטופניה באנשים עם כשל כבדי. הסרה חלקית של הכבד בחולדות גרמה להפחתה במספר הטסיות יחסית למסת הכבד שהורחקה (Siemensma וחב' ב-J Lab Clin Med משנת 1975). בנוסף, רמות TPO בפלזמה נמוכות משמעותית במטופלים עם צמקת הכבד (Peck-Radosavljevic וחב' ב-J Hepatol משנת 1997). השתלת כבד במטופלים עם אי-ספיקת כבד, הביאה לעלייה ברמות TPO ובספירת טסיות-דם שחזרו לרמתן הנורמאלית (Peck-Radosavljevic וחב' ב-Blood משנת 2000).

תרומבוציטופניה כתוצאה מנוגדנים כנגד TPO

בניסוי קליני בו הוזרק לגופם של מטופלים הריקומביננט של TPO הידוע כ-PEG-rHuMGDF, נוצרו נוגדנים כנגד חלבון מוזרק זה בחלק מהמטופלים, מה שגרם לתגובה של הנוגדנים עם TPO אנדוגני ולנטרולו. כיוון ש-TPO נוצר באופן קונסטיטוטיבי, המטופלים האחרונים פיתחו חסר TPO ותרומבוציטופניה חריפה על רקע של חסר בולט במגקריציטים (Li וחב' ב-Blood משנת 2001 ו-Basser וחב' ב-Blood משנת 2002). בשנת 2004 פרסמו Aledort וחב' ב-Am J Hematol תוצאות מחקר בו נסקרו 205 מטופלים עם ITP, אך רק באחד מהם נמצאו נוגדנים עצמיים ל-TPO.

Congenital amegakaryocytic thrombocytopenia או CAMT על רקע של חסר הקולטן ל-TPO

תרחיש של CAMT הוא מפגע נדיר המתבטא בתרומבוציטופניה חריפה, וחסר מגקריוציטים במח העצם. חלק מהמטופלים עם מפגע זה הם הומוזיגוטים למוטציות המייצרות קולטן בלתי פעיל של TPO, מה שמביא ליצירה מינימאלית של טסיות-דם באופן דומה למה שנמצא בעכברי knock-out עם חסר ב-c-Mpl (עפ"י Heckl וחב' ב-Blood משנת 2011). חלק ממטופלים אלה מפתחים בדיעבד אפלזיה של מח העצם, מה שמאשר את ההשפעה המגוונת של פעילות TPO (עפ"י Ihara וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1999, ו-van den Qudenrijn וחב' ב-Br J Hematol בשנת 2000).

תרומבוציטוזה ופגמים כרומוזומאליים

מספר פגמים המאטו-פויאטיים הכרוכים עם תרומבוציטמיה או עם יצירה של מגקריוציטים בלתי-תקינים, נקשרו עם פגם של inversion בזרוע הארוכה של כרומוזום 3 (עפ"י Pinto וחב' ב-Br J Hematol משנת 1985), ומספר לויקמיות מייאלואידיות הכרוכות בתרומבוציטוזה נגרמות משחלופים בין אתרים 3q21 ו-3q26 (עפ"י Schnittger וחב' ב-Leukemia משנת 1996). כיוון שהגן של TPO ממוקם בכרומוזום 3q27-28, עלתה השערה שהגן ל-TPO יכול לתווך בהופעת הפגמים בכרומוזום 3. יחד עם זאת, בחינה מדוקדקת יותר של האתרים הכרומוזומאליים האמורים במטופלים עם מפגעים אלה, לא הראו מעורבות של הגן ל-TPO ואמנם רמות TPO היו תקינות בלויקמיה מייאלואידית חריפה (AML), עפ"י Bouscary וחב' ב-Br J Hematol משנת 1995.

מפגעי ממאירות מיאלו-פרוליפרטיביים

מוטציות ברצף DNA ב-exon 10 באונקוגן MPL של נגיף לויקמיה מיאלו-פרוליפרטיבית, נמצאות בערך ב-5% מהמטופלים עם essential thrombocytopenia או ES, אך לא באלה עם polycythemia vera או עם לויקמיה מייאלואידית כרונית. האונקוגן MPL מקודד לאנזים טירוזין קינאז הטרנס-ממברנאלי, והמוטציות השכיחות ביותר ב-MPL הן שחלופים ב-bp בודד בקודון 515. משך ההישרדות של מטופלים עם ES והמוטציה באונקוגן PML אינו שונה מזה של מטופלים הנושאים את המוטציה V617F ב-JAK2 או את המוטציה בגן CALR המקודד לחלבון calreticulin.

תוצאות של רמות TPO בתרחישים שונים

  1. ריכוזי TPO מוגברים פי-10-20 מעל רמתם הנורמאלית הממוצעת במפגעים של מח העצם כמו באנמיה אפלסטית, או לאחר טיפול כימותרפי לצורך אבלציה של השורה המייאלואידית (עפ"י Emmons וחב' ב-Blood משנת 1996).
  2. רמות TPO בפלזמה יכולות להיות נורמאליות או אף מעט מוגברות ב-essential thrombocytopenia (עפ"י Horikawa וחב' ב-Blood משנת 1997).
  3. רמות TPO עשויות לסייע בהבדלה בין מצבים של עלייה בייצור של טסיות-דם (כאשר רמת TPO בפלזמה היא נורמאלית) לבין מצבים של ירידה בייצור טסיות-דם (בהם רמות TPO בפלזמה מוגברות).
  4. רמות TPO מוגברות אך מעט מעל הרמה הנורמאלית במצב של ITP אוimmune thrombocytopenia כאשר ספירת טסיות הדם ניתנת להשוואה עם זו במצבים של כּשל מח העצם. הרמה היחסית נורמאלית של TPO ב-ITP, משקפת כנראה פינוי מוגבר של TPO כתוצאה ממסה מוגברת של מגקריוציטים במח העצם וכן כתוצאה משטף מוגבר של טסיות-דם בצירקולציה (עפ"י Emmons וחב' ב-Blood משנת 1996).

ויסות הביטוי של TPO

מצופה שרמותיו של המווסת הפיזיולוגי של יצירת טסיות-דם, TPO, ישתנו במִתאם הפוך לספירת טסיות הדם במטופלים עם אנמיה אפלסטית (Nichol וחב' ב- J Clin Investמשנת 1995). אנליזה של Northern blot של איברים רבים, גילתה ש-TPO אמנם מבוטא במגוון רחב של איברים, כאשר רמת RNA ל TPO מבוטאת יותר מכול בכבד של חיות נורמאליות, אך גם בכליות, בתאי שריר חלק, וכן במוח ובאשכים (Bartley וחב' ב-Cell משנת 1994, וכן Lok וחב' ו-de Sauvage וחב', שני האחרונים ב-Nature משנת 1994).

בהתבסס על היכולת של טסיות-דם לספוח TPO מהדם, להחדיר את המולקולה הזו אל תוך התא ולהרוס אותה, הציעו Kuter ו-Rosenberg ב-Blood בשנת 1995, וכן Fiedler וחב' באותו כתב עת בשנת 1996, שוויסות רמות TPO בפלזמה תלוי במלואו במספר הטסיות: לכן במטופלים עם תרומבוציטוזיס רמת TPO בפלזמה נמוכה, ולעומת זאת במטופלים עם תרומבוציטופניה בהם רק מעט מה-TPO נספח על ידי טסיות-דם, רמת TPO גבוהה.

יש כמות הולכת וגדלה של ראיות המרמזות לכך שישנם מנגנונים נוספים המשפיעים על ביטוי TPO. ברמה בסיסית של טסיות-דם קשה מאוד לגלות בתאי סטרומה במח העצם עקבות של mRNA ספציפי ל-TPO. יחד עם זאת, רמת עותקי mRNA אלה עולה באופן בולט בתאי סטרומה בתגובה לתרומבוציטופניה (עפ"י Guerriero וחב' ו-Sungaran וחב' שניהם ב-Blood משנת 1997, וכן Hirayama וחב' ב-Blood משנת 1998, ו-McCarty ב-Blood משנת 1995). בנוסף, גם מספר תרחישי דלקת יכולים להעלות את רמת TPO בפלזמה יותר ממה שהיה מצופה על בסיס מספר טסיות הדם (Cerutti וחב' ב-Br J Hematol משנת 1997 ו-Tacke וחב' ב-Liver משנת 2002) אם כי על פי Wang וחב' ב-Am J Med משנת 1998, לא מדובר בממצא גורף לכל מצבי הדלקת. העלייה בסינתזה של TPO המושרית על ידי דלקת, נעשית בתיווך של IL-6, והדבר הודגם in vivo וגם in vitro על ידי Kaser וחב' ב-Blood משנת 2001, כמו גם Wolber ו-Jelkmann ב-J Interferon Cytokine Res משנת 2000, ו-Wolber וחב' ב-Thrombosis Hemostasis משנת 2001).

המנגנון לפיו יצירת TPO מווסתת בתאי סטרומה במח העצם פחות ברורה. ידוע שסינתזת TPO מעודדת על ידי גורמי הגדילה FGF2 ו-platelet α granule PDGF-BB, היא מעוכבת לעומת זאת על ידי TGFβ, וכן על ידי platelet factor 4 ו-thrombospondin (עפ"י Sungaran וחב' ב-Blood משנת 2000). יתרה מכך, ATRA או all trans retinoic acid מגביר את רמות TPO בדם, תגובה הנעשית בתיווך של RARE או retinoic acid response element (עפ"י Kinjo וחב' ב-Exp Hematol משנת 2004). נראה אם כך שתאי סטרומה במח העצם יכולים לייצר TPO בהיותם מושרים על ידי גירויים "חיצוניים", מה שעשוי להסביר את התגובה לגירויי דלקת.

הוראות לביצוע הבדיקה

הדם נלקח במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב), ולאחר הסרכוז והפרדת הנסיות מהתאים יש להקפיא מייד, וזו גם צורת המשלוח למעבדה כנסיוב קפוא, שכן דגימות נסיות המגיעות בטמפרטורת החדר, או כדגימות מקוררות נפסלות. דגימות הנסיוב יציבות לצורך בדיקה זו 30 יום בהקפאה לטמפרטורה של מינוס 20 מעלות, ויציבות למשך 7 שנים בהקפאה במינוס 70 מעלות. יש לקחת בחשבון שרמות TPO בנסיוב נתונות לשינויים על פי מועד לקיחת הדם על פני שעות היום בשל מחזוריות במהלך שעות היממה. לכן, מומלץ להקפיד על נטילת דם תמיד באותה שעה מאותו נבדק לצורך מעקב אחרי רמת TPO לאורך זמן. הבדיקה מתבצעת בשיטת immunoassay.

ראו גם