קלפונין - Calponin

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
קלפונין
Calponin
250px
מעבדה	פתולוגיה
תחום	כיווץ של תאי שריר חלק.
טווח ערכים תקין	בדם: 0.13-20.0 ננוגרם/מ"ל.
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

מטרת הבדיקה

אפיון של גידולים של שריר חלק או משורת הגידולים המיו-אפיתליאלית. קלפונין הוא סמן כאשר מבדילים בין קרצינומה צינורית in situ מקרצינומת שד תסנינית.

כללי

קלפונין הוא חלבון קושר actin הכרוך ברגולציה של התכווצות השריר החלק ובהתבססות של השלד הציטופלזמטי (Hsieh ו-Jin ב־Front Cell Develop Biol משנת 2023). קלפונין זוהה לראשונה בשריר חלק של קֻרְקְבָן (קיבת השרירים של עופות) שאופיין מאוחר יותר כחלבון פילמנטי הקשור ל-actin המכיל בערך 300 חומצות אמינו (Liu ו-Jin ב-Gene משנת 2016). קלפונין פועל כחלבון קושר סידן המעכב את הפעילות של myosin בשריר החלק. פוספורילציה של קלפנין על ידי חלבון קינאז משחררת של העיכוב של ATPase בשריר החלק, התלוי בחלבון קושר הסידן calmodulin. שיבוט של cDNA קבע את הנוכחות של שלושה איזופורמים של קלפונין, והם calponin 2 ,calponin 1 ו-calponin 3. מחקרים רבים בוצעו על calponin 1 בשרירים חלקים. קלפונין מתאם את הפעילות של actomyosin ATPase, ויוצר השפעה ביצירה של כוח מכווץ בתאי שריר חלק (Horowitz וחב' ב-Am J Physiol משנת 1996). אף על פי שהוא קשור מאוד לרקמת השריר החלק, קלפונין גם מעורב במסלולי איתות תאיים הכרוכים בסידן ובשפעול של ERK (‏Kajuluri וחב' ב-J Cell Mol Med משנת 2024).

מבנה ותפקוד

קלפונין הוא פילמנט דקיק בעל משקל מולקולרי של 34 קילודלטון. הליבה המאוד משומרת מורכבת ממקטע הומולוגי של קלפונין, משני motifs הקושרים אקטין, ומשלושה החזרים (repeats) דמויי קלפונין. שלושת האיזופורמים משומרים בקצה ה-N-טרמינלי שלהם ובאזורים המרכזיים שלהם, אך הם שונים בקצה ה-C טרמינלי שלהם, מה שמסביר את ההבדלים במטען שלהם. CNN1 משחק גם תפקיד באיתות תאי על ידי שהוא פועל כשלד הקושר protein kinase C, וכן RAF ,MEK ו-ERK ביחד, מה שמעודד שפעול של ERK התלוי ב-protein kinase C בתאי שריר חלק.

מחקר המשתמש ב-CNN1 בעכברים מצא ש-CNN1 הוא בעל השפעה שלילית על הרגולציה בריגוש סידן, כלומר ללא CNN1, תאי שריר חלק שומרים על הטונוס ההתכווצותי שלהם לפרק זמן ארוך יותר. מעבר לשריר החלק, קלפונין משחק תפקיד בתנועה של תאים שאינם תאי שריר, כולל תהליכים של ספיחת תאים, תנועה, שגשוג, פגוציטוזיס, ריפוי פציעות ותגובות דלקתיות. פוספורילציה משחקת תפקיד עיקרי בוויסות התפקוד של קלפונין. אתרי הפוספורילציה הראשוניים ב-CNN1 ממוקמים באתרים ספציפיים כגון Ser175 ו-Thr184 באזור השני של קישור לאקטין. שיירים אלה מזורחנים על ידי protein kinase C, וזרחון זה משנה את הקונפירמציה המולקולרית שגורמת ל-CNN1 להיפרד מהפילמנטים של אקטין. כתוצאה מכך מתבטל העיכוב של פעילות actomyosin ATPase ומתגברת יצירת הכוח השרירי. אתרי הפוספורילציה האלה משומרים בשלושת האיזופורמים של קלפונין, מה שמציע שקיים מנגנון רגולציה משותף.

קלפונין הוא בעל שלושה איזופורמים המקודדים על ידי גנים שונים:

1. קלפונין 1 (בסיסי) מקודד על ידי גן הממוקם בזרוע הקצרה של כרומוזום 19 באתר p13.2 -13.1,
2. calponin 2 (נייטרלי) המקודד על ידי גן בכרומוזום 19באתרp13.3
3. קלפונין 3 (חומצי) המקודד על ידי גן הממוקם על כרומוזום 1 באתר-p22-p21.

האיזופורם קלפונין 1 (להלן CNN1) נחקר ביותר מבין האיזופורמים, בהיותו ספציפי לתאי שריר חלק ממוינים והוא משחק תפקיד עיקרי בכיווץ של תאי שריר חלק (Liu ו-Jin ב-Gene משנת 2016). איזופורם 2 של קלפונין (להלן CNN2) מצוי הן בשריר חלק אך גם לא בתאי שריר. CNN2 קשור לארגון השלד הציטופלזמטי והוא נקשר גם לתפקוד מקרופאגים ולמחלות קרדיו-וסקולריות. כמויות משמעותיות של CNN2 נמצאו בטסיות, בהן הוא משחק תפקיד בספיחת תאים. מחקרים הראו שביטוי CNN2 מווסת על ידי מתח מכני בשלד התאים, כאשר רמות גבוהות יותר שלו נמצאו בתאים הנמצאים במתח מכני גדול יותר. איזופורם 3 של קלפונין (להלן CNN3) נחקר פחות משני האיזופורמים הקודמים. הוא אינו מוגבל לשריר החלק, אך נוכח לא בתאי שריר כולל אלה הנמצאים במוח. CNN3 משתתף בפעילויות של אקטין בשלד התא, במהלך ההתפתחות העוברית ובמיוגנזה. Knockout סיסטמי בעכברים גורם למותם בשלב העוברי בגין פגמים בהתפתחות של ה-CNS, מה שמתאים לתפקיד החשוב של הרקמה העצבית. עובדה זו נמצאת בניגוד ל־CNN1 ול-CNN2 בהם למרות ה-knockout העכברים נותרים בחיות מלאה והם אף פוריים. כל שלושת האיזופורמים האמורים שנקבעו על ידי שיבוט של cDNA שונים בצורות הקשירה שלהם. ישנם שני אזורים של קלפונין שיש להם אתר קישור דומה על אקטין, החשובים לאינטראקציה ולצורת הפעולה של קלפונין. CNN1 משחק תפקיד בשריר החלק הווסקולרי דרך העיכוב שלו הנגרם על ידי התגובה המולקולרית של שפעול ERK והפחתת הרגישות לסידן. CNN3 משתתף בפעילויות של האקטין הציטו-שלדי המתרחשות במהלך מיוגנזה. זה הופך את התפקיד של CNN3 לגדול יותר מאשר מעורבותו במערכת העצבים.

קלפונין בנוי בעיקר מ-α-helices וקשרי מימן. קלפונין הוא חלבון נקשר המורכב משלושה מקטעים: Calponin Homology (CH) ,regulatory domain (RD) ו־Click-23 שהוא מקטע המכיל את ההחזרים (repeats) של קלפונין. חלבון זה נקשר ל-α-actin ול-filamin דרך CH domain בתוך ה־RD domain. החלבון calmodulin לאחר שפעולו על ידי סידן עשוי להיקשר באופן חלש ל־CH domain ובכך לעכב את קישור calponin ל-α-actin, ולווסת את האינטראקציה בין אקטין ומיוזין. יש מחשבה שקלפונין הוא בעל השפעה שלילית על תהליך יצירת עצם בגין היותו ובכמויות גדולות באוסטאובלסטים. קלפונין אחראי לקישור של חלבונים רבים לאקטין ולפוספוליפידים.

המשמעות הקלינית

מחלות קרדיו-וסקולריות: CNN2 מבוטא ברמות משמעותיות במקרופאגים, ובחסרונו יש שינוי בפגוציטוזיס על ידי מקרופאגים, ובנדידתם. מחקרים במודל של עכברים הראו שהרחקת CNN2 מהמקרופאגים, הפחיתה את ההתפתחות של נגעי טרשת עורקים (Liu ו-Jin ב-J Mol Cell Cardiol משנת 2016). הרחקת הגן ל-CNN2 במחקר מצא ירידה בהסתיידות של המסתם האאורטי במודל של עכברים (Plazyo וחב' ב-J Mol Cell Cardiol משנת 2012).

מידע קליני

קלפונין הוא חלבון ציטו-שלדי שיכול להיקשר לאקטין, טרופומיוזין, טרופונין C וקלמודולין, והוא כרוך במודולציה של כיווץ שריר חלק. הביטוי של קלפונין הודגם בתאי שריר חלק של כלי-דם ושל תאים מיו-אפיתיאליים באוניות (lobules), בצינוריות מובילות החלב ובסינוסים בשד (Russell וחב' ב-Am J Pathol משנת 2015, ו-Gray וחב' ב-Proc IEEE Int Symp Biomed Imaging משנת 2018).

רגולציה

האיזופורמים של קלפונין נתונים לרגולציה ברמות השעתוקיות והבתר-שעתוקיות, מה שמאפשר לתאים להסתגל למצבים שונים רבים. בתאי שריר חלק, CNN1 מבוטא בעיקר בפאזה התכווצותית, ומכיל בערך 110 חומצות אמינו. כאשר תאים אלה נודדים לפנוטיפ יותר שגשוגי, כמו במחלה או בפציעה, הביטוי של רמות CNN1 נמוך יותר. נתון זה מראה שקלפונין אינו חשוב רק לכיווץ שריר אלא גם להחזיר תאי שריר חלק למצבם הסדיר. CNN2 נמצא מוגבר בתאים המצויים במתח מכני גבוה יותר, מה שמצביע על קלפונין כמשחק תפקיד בטרנסדוקציה מכנית, בה תאים ממירים כוחות פיזיקליים לאיתותים ביוכימיים. הודות לכך, קלפונין מסייע לתאים להגיב לשינויים בסביבתם כגון בכלי-דם. מודיפיקציות בתר-תרגומיות אחרות יכולות להשפיע על תפקוד קלפונין, כולל פוספורילציה של טירוזין, פוספורילציה של MEKK1, או אפילו מתילציה. שינויים אלה יכולים להשפיע על המבנה והזיקה של יכולת קלפונין להיקשר לאקטין ולחלבונים אחרים, מה שנותן לתאים דרך נוספת לארגן את המבנה הציטו-שלדי ואת פעילות הכיווץ.

התפקיד ברקמות

קלפונין הוא בעל חשיבות במהלך ההתפתחות והעיצוב מחדש של הרקמות. במהלך ההתפתחות העוברית, קלפונין עוזר לרגולציה של הארגון הציטו-שלדי והתמיינות התאים. CNN3 חשוב להתפתחות נכונה של מערכת העצבים, שכן מחקרים בעכברים שהם knockout הראו פגמים התפתחותיים חמורים ותמותה מוקדמת. ברקמות בוגרות, קלפונין כרוך בריפוי פציעות ובתיקונן. קלפונין מסייע לפקח על תנועת תאים ועל כיווץ שרירים, החיוניים לסגירת פציעות. הוא משחק תפקיד בתגובות דלקתיות. לדוגמה, CNN2 במקרופאגים משפיע על הדרך תאים אלה נודדים ומבצעים פגוציטוזיס. קלפונין נלמד גם כיעד תרפויטי. בסרטן, CNN1 משחק תפקיד מורכב בהיותו מופחת במספר סוגי סרטן כגון leiomyosarcoma ולעומת זאת הוא מוגבר בסוגי סרטן אחרים. שחזור הביטוי של קלפונין במספר שורות תאי סרטן נמצא להפחית את התפתחות המחלה (Taniguchi ב-Cancer Sci משנת 2005, ו-Zhou וחב' ב־Front Pharmacol משנת 2023). הרחקת CNN2 במודלים של עכבר הראתה הפחתה בטרשת עורקים כמו גם הפחתה בהסתיידות של המסתם האורטלי. ממצאים אלה תומכים ברעיון שחסימת מסלולי קלפונין עשויה להוות טיפול קליני.

שריר חלק הוא סוג של שריר לא-רצוני הפועל ללא בקרה מוּדָעת. הוא יוצר את הקירות של מבנים ואיברים רבים, כולל כלי-דם, מערכת העיכול, מעברים נשימתיים ושלפוחית השתן. הכיווץ של שרירים אלה אחראי לתהליכים כגון רגולציה של לחץ-דם, העברת מזון במעיים, ושליטה על מעבר אוויר בריאות. כיווץ זה מודרך על ידי אינטראקציה של שני חלבונים אחרים, אקטין ומיוזין. קלפונין משחק תפקיד מאפנן (modulating) בתהליך הכיווץ. הוא פועל כמעכב תוך הגבלת האינטראקציה בין אקטין ומיוזין. באופן ספציפי, הוא מעכב את האנזים actomyosin Mg-ATPase, שפעילותו נחוצה לכיווץ שריר. על ידי עיכוב אנזים זה, קלפונין מסייע לקביעת עוצמת ומשך הכיווץ. ההשפעה הרגולטורית של קלפונין מפוקחת על ידי פוספורילציה של קלפונין. התפקוד של קלפונין מוגדר על ידי האינטראקציה שלו עם טרופומיוזין העוטף את הפילמנטים של אקטין. הפעילות של קלפונין מושפעת גם על ידי calmodulin, חלבון קטן הקושר סידן. כאשר רמות סידן גדלו בתוך תא שריר, קלמודולין נקשר לסידן, והצמד הזה מגיב עם קלפונין וגורם לו להתנתק מאקטין ולהפוך את השפעתו המעכבת.

הוראות לביצוע הבדיקה

הבדיקה מתבצעת בשיטת immunohistochemistry (IHC), ברקמה הנבדקת. מועדפת רקמה מקובעת עם פורמלין, שעברה embedding על ידי פרפין, או שתי זכוכיות נושא בלתי צבועות, טעונות חיובית (בממדים של 25, 75, 1 מילימטר) כאשר עובי הרקמה 3 מיקרון. יש לפסול דגימות במקרים הבאים: זכוכיות נושא לא-טעונות, רקמות שלא עברו קיבוע בפורמלין, ממרחים ציטולוגיים, רקמות לחות או קפואות, רקמות שלא עברו embedding בפרפין, זכוכיות נושא ProbeOn, זכוכיות נושא "מצופות שלג".

את הדגימות יש לשלוח למעבדה בטמפרטורת החדר (מועדף) או בקירור. הגיל של עובי השכבה המטופלת בפרפין עלול להשפיע על האימונו-ריאקטיביות. החתכים הטובים ביותר המטופלים בפרפין צריכים להיות בני עד 6 שבועות. המטען של זכוכיות הנושא עלול להיות מושפע על ידי גורמים סביבתיים ועלול להשפיע על צביעת החתך. הדרך הטובה ביותר בה יש לנקוט לאחסון זכוכיות נושא טעונות חיובית היא היא במזעור משך הזמן של האחסון, בהגבלת החשיפה ללחות גבוהה ולחום, ובהגבלת החשיפה לחומרים פלסטיים (Magaki וחב' ב־Methods Mol Biol משנת 2019).

כאשר הבדיקה מתבצעת בפלזמה שיטת הבדיקה היא סנדוויץ-כפול בו הערכה המסחרית מסופקת עם פלטת מיקרו-טיטר בה הבארות מצופות עם נוגדן כנגד CNN1. מוסיפים לבארות את דגימת הפלזמה המהולה בטמפרטורת החדר להדגרה משך 1-2 שעות כאשר אחריה שוטפים את הבארות עם PBS המרכיבים בדגימה שלא נקשרו לנוגדן הספוח על הבארות. לאחר מכן מוסיפים לבארות את הנוגדן השני המסומן עם ביוטין והמכוון כנגד הנוגדן הספוח הראשון. גם כאן מתבצעת הדגרה של 1–2 שעות ואחריה שוב שטיפה להרחקת מרכיבים שלא נקשרו. כעת מוסיפים תמיסת TMB המשמש כמצע. ה-TMB עובר קטליזה על ידי HRP ליצירת צבע כחול, ההופך לצהוב לאחר הוספת תמיסת עצירת הריאקציה. יש לקרוא את בליעת ה-OD באורך גל של 450 ננומטר, על ידי microplate reader. יש לחשב את ריכוז CNN1 בתמיסה על ידי עקומת סטנדרט. הריכוז של CNN1 פרופורציונלי לערך של הבליעה ב-450 ננומטר.

רגישות השיטה: 0.188 ננוגרם/מ"ל.

ראו גם

• חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה
• בדיקות מעבדה - מפגעי מערכת העצבים והמוח
• בדיקות מעבדה - סמנים סרטניים

המידע שבדף זה נכתב על ידי פרופ' בן-עמי סלע, המכון לכימיה פתולוגית, מרכז רפואי שיבא, תל-שומר;
החוג לגנטיקה מולקולארית וביוכימיה, פקולטה לרפואה, אוניברסיטת תל-אביב (יוצר הערך)