דיווח המעבדה בנושא תוצאות בדיקה גנטית למחלת ניוון שרירים על שם דושן במסגרת סקר אוכלוסייה - נייר עמדה - Duchenne muscular dystrophy

ערך זה נמצא בבדיקה ועריכה על ידי מערכת ויקירפואה, וייתכן כי הוא לא ערוך ומוגה.

ערך זה הוא נייר עמדה סגור לעריכה
דיווח המעבדה בנושא תוצאות בדיקה גנטית למחלת Duchenne Muscular Dystrophy במסגרת סקר אוכלוסיה
תחום	גנטיקה; נוירולוגיה
250px
האיגוד המפרסם	איגוד הגנטיקאים הרפואים בישראל
קישור	באתר הר"י
תאריך פרסום	מרץ 2025
יוצר הערך	פרופ' לנה שגיא-דאין, פרופ' ריקי סוקניק הלוי, ד"ר מיכל ברקנשטט, ד"ר מרים גולדשטיין, ד"ר לימור קלפון, גב׳ סיגל צברי
ניירות עמדה מתפרסמים ככלי עזר לרופא/ה ואינם באים במקום שיקול דעתו/ה בכל מצב נתון. כל הכתוב בלשון זכר מתייחס לשני המגדרים.

לערכים נוספים הקשורים לנושא זה, ראו את דפי הפירושים: – מעקב היריון ובדיקות סקר טרום היריון; דיסטרופיה מיוטונית

הקדמה

מחלת Duchenne Muscular Dystrophy (להלן DMD) היא הצורה השכיחה של ניוון שרירים בקרב ילדים, המאובחנת בשכיחות של 1:3500 עד 1:5000 לידות חי. מצב זה מהווה את הקצה החמור של ספקטרום המחלות מקבוצת dystrophinopathies, הנגרמות על ידי שינויים גנטיים בגן DMD=Dystrophin‏ (OMIM #300377). שינויים גנטיים גורמי המחלה הנפוצים ביותר בגן DMD הם חסרים גדולים (60-65%) או תוספות (10-15%). על פי "כלל מסגרת הקריאה" המתקיים בכ-90% מהמקרים, שינויים גנטיים המשבשים את מסגרת הקריאה של דיסטרופין קשורים בדרך כלל למחלת DMD, בעוד שווריאנטים ששומרים על מסגרת הקריאה ומאפשרים ייצור של דיסטרופין פונקציונלי חלקית גורמים לרוב לניוון שרירים על שם בקר (BMD), מחלת דיסטרופינופתיה קלה יותר עם הופעת תסמינים מאוחרים יותר . עם זאת, מוכרים שינויים גנטיים בגן DMD בעלי ווריאביליות משתנה, שיכולים להביא למחלת דושן וכן בקר.

שיטות הבדיקה המקובלות בישראל לאיתור נשאיות למחלת דושן כוללות את השיטות MLPA, סקר מורחב בשיטות NGS- microarray. שיטות אלו אינן מאפשרות להגדיר את השפעת השינויים על מסגרת הקריאה, ואינן מאפשרות לקבוע בצורה מהימנה את גבולות החסר או ההכפלה.

ביוני 2020, בדיקה גנטית לאיתור חסרים ותוספות בגן DMD הוכנסה לרשימת הבדיקות המומלצות במסגרת סקר אוכלוסייה, במימון משרד הבריאות. במהלך ביצוע הסקר, נצפה כי בחלק מהשינויים הגנטיים שאובחנו לא קיים מידע מספק לגבי הפנוטיפ, על כן הייעוץ הגנטי היה מוגבל מאוד מבחינת הפרוגנוזה הצפויה לצאצאים וההמלצות הניתנות למטופלת בהקשר זה. המגבלה בהגדרת המשמעות הקלינית של ממצאי הסקר קשורה בעיקר למבנה הגן המורכב מ-79 אקסונים ו-8 פרומוטורים המפוזרים לאורכו כאשר הפעלתם תלוית רקמה (300377 MIM).

סיכום ביניים של 85,737 תוצאות בדיקת הסקר הוצג בישיבת איגוד הגנטיקאים בתאריך 13.9.22 (נספח מספר 1). לאור מספר סוגיות בעייתיות בבדיקת הסקר, הוקמה וועדה ייעודית לבדיקת הנושא. להלן התייחסות הוועדה לסוגיות הבולטות.

ההמלצות לדיווח הממצאים נדונו בישיבת איגוד הגנטיקאים בתאריך 07/06/2023 וכן ב- 16/01/2024.

שינויים אשר ככל הנראה לא קשורים לבעיות רפואיות משמעותיות (likely benign) ושינויים בעלי משמעות לא ברורה (VUS)

מדובר בעיקר בשינויים שהשפעתם על מסגרת הקריאה על פי מאגרי מידע שונים אינה ברורה (difficult to predict). דוגמאות לשינויים מסוג likely benign כוללות דופליקציות בתחילת הגן או בסוף הגן, דופליקציה של הפרומוטר dp427c (השכיח בייחוד במוצא בוכרי), או חסר אקסונים 16-22 (שלא נמצא מידע בספרות והודגם אצל נקבה הומוזיגוטית) - ראו נספח מספר 2.

בנוסף, מוכרים שינויים בעלי משמעות קלינית לא ידועה/ לא ברורה - כאשר לא נמצא מידע מספק בספרות או במאגרי מידע ארציים ובינלאומיים להגדרת המשמעות הקלינית שלהם.

בהמשך לקריטריונים של משה"ב ואיגוד הגנטיקאים ("בדיקת סקר נועדה לאתר מחלות חמורות וחשוכות מרפא, מאופיינות בחדירות מלאה, עם שיעורי תחלואה ו/או תמותה גבוהים מגיל הילדות") - המלצת הוועדה היא לא לדווח על שינויים מסוג זה.

מדובר במצבים שאין מידע בספרות התומך בכך שהממצא הגנטי הספציפי קשור במחלת DMD/BMD, כשהממצא מוכר בספרות כשינוי שככל הנראה אינו קשור לבעיות רפואיות משמעותיות או בעל משמעות לא ברורה, או כשהצטבר מידע ארצי מספק שהממצא ככל הנראה אינו פתוגני (כדוגמת dp427c). יש לתעד זאת בדיסקליימר של המעבדה.

אם הממצא מדווח ומתבצעת סגרגציה משפחתית

בחלק מהממצאים הגנטיים בגן DMD לגביהם קיים מיעוט מידע בספרות, בדיקת סגרגציה מדגימה את השינוי אצל זכרים בריאים - דבר המכוון לכך שהשינוי הגנטי אינו קשור לביטוי קליני או לחלופין קשור לביטוי מאוחר יותר של המחלה (מחלת בקר). במקרים אלה עולים ספקות באשר להתנהלות הקלינית, ובאשר להכרח לדווח על התוצאה במקרים הללו.

על פי סקירת ספרות וכן התייעצות עם מומחים לנוירולוגיה ובאופן ספציפי לשינויים בגן DMD - נראה כי התחלת תסמינים קליניים היא לרוב עד גיל 30 שנים. קיימים דיווחים לא רבים על ביטוי קליני גם בגילאים מאוחרים יותר (אף בשנות השבעים). על מנת לוודא היעדר ביטוי קליני, מומלץ לקחת מהפרט הנבדק אנמנזה מדוקדקת (כולל תשאול על כאבי שרירים חריגים במאמץ), לבצע בדיקה קלינית (רצוי ע"י נוירולוג מומחה), בדיקת CPK במנוחה וכן יומיים לאחר פעילות גופנית. כמו כן, ניתן לשקול אקו לב ובדיקת EMG. אם בדיקות אלה תקינות, והפרט נושא השינוי הגנטי הינו מעל גיל 30 שנים, הדבר מוריד משמעותית את הסיכון, גם בהקשר למחלת בקר.

מאחר וייתכן קושי בהערכה קלינית נרחבת אצל זכרים נושאי שינויים גנטיים, המלצת הוועדה בהקשר זה היא לפעול על פי שיקול דעת המעבדה והצוות הקליני.

תוצאה של חסר אקסון בודד

קיימים מקרים בהם בבדיקת MLPA מתקבלת תוצאה המצביעה על חסר של אקסון בודד (המוגדר על פי הנחיות MRC Holland כאשר תוצאת MLPA הינה בטווח של 0.65 > 0.40 < FR).

בחלק מתוצאות אלה אין מדובר על חסר אמיתי של אקסון אלא בארטיפקט של הבדיקה, הנגרם עקב הפרעה בקשירה של הפרוב בשל נוכחות וריאנט באזור ההיברידיזציה. נתונים המתבססים על תוצאות הסקר ל-DMD המתבצע באוכלוסייה הישראלית, מצביעים על כך שכאשר מדובר בחסר אקסון בודד, במרבית המקרים אין מדובר בחסר אמיתי. כמו כן, עולה כי באוכלוסייה הישראלית ישנם חסרים המופיעים בקבוצות אתניות ספציפיות על רקע נוכחות של single nucleotide polymorphisms שכיחים באותה אוכלוסייה.

מתוך 85,737 בדיקות בנתוני משה"ב, נמצאו 373 מקרים של חסר אקסון בודד על רקע 28 וריאנטים שונים. מתוך וריאנטים אלה, חמישה וריאנטים ספציפיים הופיעו למעלה מ-10 פעמים בקבוצות מוצא ספציפיות.

המלצות הוועדה להתנהלות בהדגמת חסר אקסון בודד בבדיקת MLPA

1. אם מדובר בחסר אקסון בודד בו מוכר וריאנט שכיח בקבוצה אתנית ספציפית, אין צורך לבצע כל בירור נוסף ואין צורך לדווח על הממצא
   1. ממצא שכיח יוגדר כממצא שדווח בלפחות 5-10 בדיקות במוצא ספציפי
   2. רשימת האקסונים והמוצאים הרלוונטיים בהם אין צורך בבירור נוסף מפורטת בנספח 3. עדכון לנספח זה יתבצע מידי שנה על בסיס נתונים מהמאגר המשותף
2. אם מדובר בממצא שדווח בפחות מ-5-10 פעמים במוצא ספציפי, יש לרצף את אזור ההיברידיזציה של הפרוב:
   1. אם לא מודגם וריאנט - יש לדווח על חסר של אקסון בודד
   2. אם מודגם וריאנט, יש לבצע סיווג של הוריאנט על פי קריטריונים של ACMG‏:
      1. אם הסיווג המתקבל הוא של VOUS, likely benign או benign, ומאחר ומדובר בבדיקת סקר - אין צורך לדווח
      2. אם הסיווג הוא likely pathogenic או pathogenic יש לדווח

יש לפרט את התייחסות המעבדה לשינויים אלו במסגרת מידע וההבהרות המצורפים לדו"ח המעבדה (דיסקליימר).

חשד לממצא משני מחוץ לגן DMD

בדיקת DMD מבוצעת בשיטת MLPA, כאשר כלל האקסונים ומקטע dp427c של הגן מחולקים לשני קיטים, p34 ו-p35. בנוסף, בכל קיט בהתאם, כלולים 9 ו-8 פרובים של אתרי יחוס (references) של גנים שאינם קשורים לגן DMD. גנים אלו ממוקמים על כרומוזום X ומפוזרים לאורך הזרועות p ו-q. מתוך סה"כ 17 פרובים אלה, רק שלושה משותפים לשני הסטים.

תוצאות אתרי יחוס מאפשרות לאמוד את מספר העותקים של כרומוזומי X, וכן לקבוע את ערך החציון שלהם המשמש לחישוב תוצאות האקסונים של DMD על פי הוראות היצרן MRC. ניתן לאשר תוצאות של דגימה כאשר לפחות 70% (קריא, לפחות 7 מתוך 9 אתרי ייחוס בסט p34 ו-6 מתוך 8 אתרי ייחוס ב-p35) הם בעלי תוצאה תקינה = שני עותקים. בכל מקרה אחר, המלצת היצרן לחזור על בדיקת DMD של אותה דגימה.

ישנם מצבים בהם מתקבל בכל חזרה שינוי במספר עותקים של אתר ייחוס אחד או יותר. במקרים אלו עולה חשד לשינוי אמיתי במספר העותקים בגנים הרלוונטיים, כלומר חשד לממצא משני מחוץ לגן.

במקרים אלו, ניתן להתייחס לתוצאת DMD כתקינה.

ממצאים אחרים בבדיקה זו, שאינם קשורים למחלת דושן, לא ידווחו במסגרת בדיקת הסקר.

(*) מצ"ב רשימת גנים מהיצרן המשמשים כאתרי ייחוס, כולל האם קיים קיט MLPA עבורם (נספח מספר 4).

הקמת מאגר מידע ייעודי

מאגרי מידע לשינויים גנטיים בגן DMD הקיימים ונמצאים בשימוש לסיווג הממצא כוללים מאמרים בספרות הרפואית, Clinvar, מאגר מידע הולנדי Leiden Open Variation Database, מאגר מידע צרפתי, Edystrophin ועוד (נספח מספר 5).

המידע שנצבר במאגרים אלו הוא מצומצם, הוא מציג מידע על חולים, ואינו בהכרח מתאים לאוכלוסייה בישראל. מאחר ובמהלך תקופת הסקר משנת 2020 נצבר ידע רב על שינויים גנטיים כוללים חסרים ותוספות ופולימורפיזמים ייחודיים ובשכיחות גבוהה יותר באוכלוסיות ומוצאים שונים בישראל, לצורך קבלת החלטות עבור מתן ייעוץ גנטי מהימן קיים הכרח לאיגוד נתוני הסקר והממצאים הקיימים עד כה לכדי מאגר ארצי לשינויים גנטיים בגן DMD. המאגר יכלול חלוקה נפרדת עבור ממצאי חסרים ותוספות בגן וממצאים של שינויים נקודתיים שיאותרו במסגרת ריצוף במקרה של ממצא בטווח "אפור" (0.7).

במאגר ירוכזו כלל השינויים הגנטיים שמאותרים במעבדות השונות ויאוגדו למסמך אחד שיכיל:

• מספר מעבדה
• תיאור השינוי: גודל ומיקום
• מוצא המטופל/ת
• מטרת הבדיקה: סקר/חולה/מחלה במשפחה
• האם בוצעו בדיקות בני משפחה לשינוי, עם תיאור תוצאה
• סיווג השינוי הגנטי

בשלב הראשון יפורסמו נתוני 2021-2022 שייאספו ויוצגו ל"אנשי מקצוע" באתר של המחלקה לגנטיקה קהילתית. בהמשך תידרש בניית מאגר ארצי (בדומה למאגר CMA) אליו יופקדו הנתונים כאחת לחצי שנה. תהיה חובת דיווח לכלל המעבדות.

• יש צורך בחשיבה משותפת מעשית לחיבור נתוני הסגרגציה מהמעבדות השונות עבור אותו נבדקת בסקר שאצלה בוצע השינוי - ושהדיווח יהיה ללא כפילויות
• ההמלצה על דיווח הממצאים מתייחסת גם לשינויים גנטיים בגן DMD המאותרים במסגרת NGS

נספחים

נספח מספר 1

סיכום תוצאות של 85,737 בדיקות גנטיות למחלת DMD במסגרת סקר אוכלוסייה.

ב-535 מקרים (0.62%) הודגמו שינויים מסוג חסרים או תוספות.

ב-386 מתוך המקרים הללו הודגם חסר של אקסון בודד, אך במרבית ממקרים אלה (373) הסתבר שמדובר בתוצאה חיובית כוזבת false positive, מאחר ובדיקת ריצוף הדגימה שינוי נקודתי ברצף שפגם בקישור הפרובים של בדיקת MLPA. מתוך 373 שינויים false positive, בלטו מספר שינויים נקודתיים שחזרו מספר פעמים במוצאים מסוימים - בדגש על השינוי c.831+10G>A במוצא מרוקו, והשינוי c.7016A>G במוצא ערבי מוסלמי.

מתוך 162 חסרים ותוספות "אמיתיים", מחציתם (82) הוגדרו כבעלי משמעות קלינית (שינויים הפוגמים במסגרת הקריאה, שינויים שדווחו בספרות כקשורים ל-DMD/BMD, או על פי סיפור משפחתי חיובי). 80 שינויים הוגדרו כבעלי משמעות לא ברורה - שינויים אלה כללו בעיקר תוספות באיזור הפרומוטר מסוג dp427c ‏(58 מקרים בעיקר במוצא בוכרי), תוספות שכוללות אקסון 1 או אקסונים אחרונים של הגן, וכן חסר אקסונים 16-22 שלא תואר בספרות והודגם אף אצל אישה הומוזיגוטית.

נספח מס' 2: שינויים מסוג likely benign

The result n LOVD UMD Leiden cases Segregation Del 16-22 7 In Frame In Frame Carrier females homozygous healthy 2 females Dup 1-2 2 DiffToPred In Frame ־ Dup 1-12 1 DiffToPred In Frame ־ ־ Dup 1-15 1 DiffToPred In Frame carrier female 1 Healthy hemizygous father Dup dp427c 58 DiffToPred DiffToPred ־ Dup dp427c + exon 1 1 DiffToPred DiffToPred ־ Dup dp427c + exon 1-7 2 DiffToPred DiffToPred ־ Dup dp427c + exon 1-12 1 DiffToPred DiffToPred ־ Dup 1-7 3 DiffToPred DiffToPred (not relevant( 3 Healthy hemizygous father Dup 61-79 1 DiffToPred DiffToPred ־ Dup 63-79 1 DiffToPred DiffToPred BMD, 1 1 healthy female Dup 78-79 1 DiffToPred DiffToPred ־ Dup all exons 1 DiffToPred DiffToPred ־

דיווח המעבדה בנושא תוצאות בדיקה גנטית למחלת Duchenne Muscular Dystrophy  נספח מס' 3: וריאנטים נקודתיים הגורמים לתוצאה false-positive של חסר אקסון בודד בבדיקת MLPA. The FP deleted exon The single nucleotide variant (NM_004006.3) (%) n Origin Classification 1 c.-188C>T (0.02%( 18 Jewish (VUS (BP7 8 c.831+10G>A (0.18%( 155 Mostly Moroccan Jews (VUS )PM2, BP6 48 c.7016A>G (0.14%( 122 Mostly Muslim Arabs (LB )PM2, BP4 48 c.7018C>T (0.007%( 6 Christian Arabs (LB )PM2, BP7 69 c.9975-24G>A (0.01%( 14 Mostly Muslim Arabs (VUS )PM2, BP7 71 c.10224-37G>A (0.02%( 20 Ashkenazi, Bedouin LB )PM2, BS2, (BP7 75 c.10677T>C (0.007%( 6 Jewish (LB )PM2, BP6+7

נספח מספר 4: רשימת גנים מהיצרן המשמשים כאתרי ייחוס Probe number Gene P034 DMD-1 B2 - Sheets version 02 MID1 PPEF1 OTC MLPA FGD1 MLPA ATP7A MLPA COL4A5 MLPA DCX MLPA AIFM1 F8 MLPA P035 DMD-2 B1 - Sheets version 01 MID1 CDKL5 MLPA PHEX MLPA GJB1 MLPA ATP7A MLPA DCX MLPA FRMD7 ARHGEF6

7 דיווח המעבדה בנושא תוצאות בדיקה גנטית למחלת Duchenne Muscular Dystrophy נספח מספר 5: - מאגר מידע הולנדי Leiden Open Variation Database: https://databases.lovd.nl/shared/genes/DMD - מאגר מידע צרפתי - /http://www.umd.be/DMD http://edystrophin.genouest.org - Edystrophin מאגר מידע - דיווח המעבדה בנושא תוצאות בדיקה גנטית למחלת Duchenne Muscular Dystrophy Reference: 1. Aartsma-Rus A, Ginjaar IB, Bushby K. The importance of genetic diagnosis for Duchenne muscular dystrophy. J Med Genet. 2016;53)3(:145-51. 2. Aartsma-Rus A, Van Deutekom JC, Fokkema IF, Van Ommen GJ, Den Dunnen JT. Entries in the Leiden Duchenne muscular dystrophy mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule. Muscle Nerve. 2006 Aug;34)2(:135-44. 3. Hoffman EP, Fischbeck KH, Brown RH, Johnson M, Medori R, Loike JD, Harris JB, Waterston R, Brooke M, Specht L, et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N Engl J Med. 1988 May 26;318)21(:1363-8. 4. Nicholson LV, Johnson MA, Gardner-Medwin D, Bhattacharya S, Harris JB. Heterogeneity of dystrophin expression in patients with Duchenne and Becker muscular dystrophy. Acta Neuropathol. 1990;80)3(:239-50. 5. Dama T, Chheda P, Limaye S, Pande S, Vinarkar S. Evaluation of Single Exon Deletions in DMD/BMD: Technical and Analytical Concerns. Neurol India. 2022 Jul-Aug;70)4(:1615-1617. 6. Kim MJ, Cho SI, Chae JH, Lim BC, Lee JS, Lee SJ, Seo SH, Park H, Cho A, Kim SY, Kim JY, Park SS, Seong MW. Pitfalls of Multiple Ligation-Dependent Probe Amplifications in Detecting DMD Exon Deletions or Duplications. J Mol Diagn. 2016 Mar;18)2(:253-9. 7. Cohen G, Shtorch-Asor A, Ben-Shachar S, Goldfarb-Yaacobi R, Kaiser M, Rosenfeld R, Vinovezky M, Irge D, Furman Y, Reiss D, Litz-Philipsborn S, Sukenik-Halevy R. Large scale population screening for Duchenne muscular dystrophy-Predictable and unpredictable challenges. Prenat Diagn. 2022 Aug;42)9(:1162-1172. 8. Richards S, Aziz N, Bale S, Bick D, Das S, Gastier-Foster J, Grody WW, Hegde M, Lyon E, Spector E, Voelkerding K, Rehm HL; ACMG Laboratory Quality Assurance Committee. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015 May;17)5(:405-24.