כניסה 
עקבו אחרינו בפייסבוק בדיקת ניטרול טסיות דם - Platelet neutralization test
| מדריך בדיקות מעבדה | |
| בדיקת ניטרול טסיות דם | |
|---|---|
| Platelet neutralization test | |
| שמות אחרים | PNT |
| 250 פיקסלים | |
| מעבדה | המטולוגיה בדם |
| תחום | מפגעים במשק הטסיות. |
 | |
| יוצר הערך | פרופ' בן-עמי סלע |
מטרת הבדיקה
סיוע באישור או בשלילה של נוכחות מעכב של lupus anticoagulant כאשר הבדיקה מתרחשת בשילוב עם מבחני קואגולציה מתאימים. הבדיקה מסייעת להבדיל בין חסרים או מעכבים של גורמי קואגולציה כגון פקטור VIII לבין מעכבי אנטי-קואגולנטים של זאבת.
כללי
ה-PNT משחק תפקיד מרכזי באבחון מפגעי דם, בעיקר אלה הקשורים לתפקוד טסיות. בדיקה זו קריטית באבחון מפגעים כגון Heparin-Induced Thrombocytopenia (להלן HIT), כמו גם autoimmune Thrombocytopenic Purpura (ITP), ומפגעי טסיות אחרים. בזיהוי של נוגדנים כנגד טסיות, PNT מסייע לקלינאים להחליט על אסטרטגית הטיפול המתאים באלה עם פעילות אנומלית של טסיות. בהשוואת בדיקה זו לבדיקות מסורתיות אחרות של קואגולציה כגון Prothrombin Time (להלן PT) ו-activated Partial Thromboplastin Time ) (להלן aPTT), בדיקת PNT מתוכננת לזהות נוגדנים המנטרלים את פעילות הטסיות, המוליכים למצבים כמו HIT ו-ITP. בניגוד לבדיקות אבחוניות אחרות המתמקדות בקסקדה של קואגולציה, PNT קובעת ישירות את פעילות הטסיות ואת ההרס האוטו-אימוני שלהן.
העיקרון של PNT
בדיקה זו פועלת לפי העיקרון של נטרול, כאשר נוגדנים בפלזמת הדם של המטופל מגיבים עם הטסיות, או על ידי עיכוב פעילותן או על ידי שהיא גורמת להם לעבור איגור (aggregation). דרגת האיגור קובעת את נוכחות נוגדנים מנטרלים אלה. בדיקת HIT מהווה אפליקציה ספציפית של PNT, הקובעת ומזהה את הנוגדנים כנגד קומפלקסים של platelet pactor 4 (להלן PF4) הנוצרים בתגובה לתרפיה עם הפארין.
אפליקציות קליניות של PNT
- אבחון של heparin-induced thrombocytopenia (HIT): המפגע HIT הוא חמור ומסוכן לחיים פוטנציאלית הנגרם על ידי יצירת נוגדנים כנגד הקומפלקסים PF4-הפארין. בדיקת PNT חיונית לאבחון HIT על ידי זיהוי הנוגדנים האמורים, הגורמים לאיגור טסיות ולפקקת הנגרמת בשל כך (Warkentin ו-Greinacher ב-Thrombosis Res משנת 2008)
- Autoimmune thrombocytopenia purpura: ב-ITP, מערכת החיסון הורסת בטעות טסיות. ה-PNT משמש לזהות את הנוגדנים כנגד גליקופרוטאינים של טסיות, ובכך הבדיקה הזו מספקת ראייה לפתו-פיזיולוגיה של ITP. הבדיקה מסייעת להבדיל בין סיבות אחרות לתרומבוציטופניה, ועוזרת לקבוע את הגישה הטיפולית המתאימה (Kuter ב-Am J Hematol משנת 2017)
- הניטור של תפקוד הטסיות: בדיקת PNT יכולה לשמש גם לצורך הערכת סטטוס התפקוד של טסיות במצבים של מחלת von Willebrand או תסמונת Bernard-Soulier, בהם פגיעה בתפקוד הטסיות תורמת לתסמיני דימום
- ניטור של תרפיה עם הפארין ואנטי-טסיות: PNT יעיל בניטור היעילות של תרפיות אנטי-טסיות ואנטי-קואגולנטים, בעיקר במטופלים המטופלים עם הפארין או עם קומאדין. הבדיקה עשויה לסייע לגלות עמידות לתרופות או ריאקציות שליליות לתרופות אנטי-טסיות
פעולת הבדיקה לניטרול טסיות
בדיקת PNT פועלת בשיטה פשוטה יחסית אך מדויקת: דגימת דם נלקחת מהמטופל ומופרדת על ידי סרכוז. הכנת תמיסת טסיות מתורם בריא, מבודדת ומוכנה בתמיסה. בהדגרה לצורך ניטרול אם יש נוכחות של נוגדנים, הם יקשרו לטסיות וינטרלו את פעילותן.
בדיקת איגור הטסיות: לאחר הדגרה נמדד איגור הטסיות. ירידה באיגור מצביעה על ניטרול הנוגדנים ומאשרת את נוכחות נוגדנים ספציפיים כנגד טסיות.
אנליזה של התוצאות: נבחנת דרגת איגור הטסיות. ניטרול חזק יותר מרמז על רמה גבוה יותר של נוגדנים שניתן להימדד.
הבדלי המפתח בין PNT לבין PT ו-aPTT
בה בשעה ש-PT, PNT ו-aPTT הן בדיקות דם, הן שונות משמעותית בדגשים שלהן ובאפליקציות הקליניות.
- PNT: מטרת הבדיקה גילוי נוגדנים המשפיעים על תפקוד הטסיות, בעיקר במצבים של תרומבוציטופניה אוטואימונית, HIT ו-ITP. הדגש בבדיקה זו הוא תפקוד טסיות והאינטראקציות עם הנוגדן. השימוש הקליני של בדיקה זו הוא אבחון של מפגעי טסיות הנובעים מסיבה אוטו-אימונית כגון HIT ו-ITP
- PT: מטרת הבדיקה היא בהערכה של המסלול האינטרינזי של קואגולציה. הדגש בבדיקה זו הם גורמי הקרישה VII, X, V, II ו-I. השימוש הקליני של בדיקה זו הוא לנטר תרפיה עם קומאדין, תפקוד כבד וגילוי חסר בגורמי קרישה
- aPTT: מטרת בדיקה זו היא הערכת המסלול האינטרינזי של קואגולציה. הדגש בבדיקה זו הם גורמי הקרישה VIII ,IX ,X ,XI ,XII, ופקטור I (פיברינוגן). השימוש הקליני של הבדיקה הוא לנטר תרפיה עם הפארין, להעריך מפגעי דימום, ולאבחן המופיליה
יתרונות ומגבלות של בדיקת PNT
יתרונות: ספציפיות גבוהה בזיהוי של נוגדנים הקשורים ל-HIT ול-ITP; הבדיקה מספקת מידע קריטי על תפקוד טסיות, מידע שאינו מסופק על ידי בדיקות אחרות כגון PT ו-aPTT; לבדיקה עלות-יעילות בהשוואה לבדיקות מסובכות יותר כגון Serotonin Release Assay (להלן SRA).
מגבלות: הבדיקה דורשת ציוד מעבדה מתוחכם, וצוות מאומן לביצועה ולאנטרפרטציה של התוצאות; עלולות להתקבל תוצאות false positive בגלל cross-reactivity עם נוגדנים אחרים; הבדיקה אינה נפוצה כמו PT ו-aPTT במעבדות שונות.
כיצד PNT שונה מ-PT ומ-aPTT? שלא בדומה ל-PT ול-aPTT, המעריכים את מסלולי הקואגולציה (חיצוניים ופנימיים), בדיקת PNT קובעת את תפקוד הטסיות ואת נוכחות נוגדנים המפריעים לפעילותן. PT ו-aPTT משמשים לניטור תרפיות של אנטי-קואגולנטים ולאבחון של חסרים ב-clotting factor, ואילו PNT מתמקד בפגיעה בתפקוד של טסיות הנגרמת על ידי מערכת החיסון.
האם בדיקת PNT מדויקת? כן, בדיקה זו ספציפית מאוד ומדויקת בגילוי של HIT ושל ITP. עם זאת, תשובות false positive עלולות להתקבל כתוצאה מ-cross reactivity, ולפיכך חיוני מאוד המתאם הקליני עם תסמיני הנבדק לצורך אבחון מדויק. תוצאה חיובית מראה את הנוכחות של נוגדנים המנטרלים את פעילות הטסיות. אך נדרשות בדיקות נוספות (כגון HIT ו-ITP) והערכה קלינית להחליט מהי הסיבה המדויקת של תרומבוציטופניה (Greinacher ו-Warkentin ב-Thrombo Res משנת 2015, Cines ו-Levine ב-Hematology/Oncology Clin North America משנת 2009).
בדיקת PNT בפלזמה עשויה לסייע באישור או בשלילה של נוכחות מעכב של lupus anticoagulant כאשר היא מתבצעת בהתייחסות למדיות קואגולציה נוספות. זמני קרישה ארוכים יכולים להיגרם בגלל חסר בגורמי קרישה, מעכבי קרישה, ואנטי-קואגולנטים של לופוס שהם נוגדנים אנטי-פוספוליפידים (Brandt וחב' ב-Thromb Haemost משנת 1995, ו-Gardel וחב' ב-Thromb Haemost משנת 1993). כאשר aPTT מאורך מדגים עיכוב כאשר מערבבים אותו עם פלזמה נורמלית כתוצאה מנוכחות של מעכב, בדיקת PNT שימושית בקביעה אם עיכוב זה נגרם מ-lupus anticoagulant. בדיקת PNT כורכת הוספה של טסיות רחוצות שהוקפאו והופשרו או בופר לפלזמה של הנבדק. כאשר מוסיפים פוספוליפידים הם יכולים לספוח lupus anticoagulant, לפיכך לקצר את aPTT. לבצע בדיקת PNT ולצורך האינטרפרטציה שלה הבסיס של aPTT צריך להיות מאורך משמעותית (לפחות ב-3–5 שניות מעל טווח הערכים התקין. פלזמה המכילה lupus anticoagulant תדגים קיצור של ה-aPTT ב-2 שניות או יותר בהשוואה ל-aPTT בבדיקת PNT ב-saline. הנוכחות הפארין תגרום לתוצאה false positive של PNT. זאת ניתן לגלות כיוון שנוכחות הפארין יכולה להתגלות על ידי thrombin time מאורך, וזמן נורמלי של reptilase. הנוכחות של מעכבי גורם קרישה V יכולה אף היא לתת תוצאת PNT שהיא false positive. ניתן לבצע את בדיקת PNT גם בדרך הבאה: שני בארות, האחד מכיל פלזמה של הנבדק, והשני מכיל פלזמה של הנבדק וריאגנט של טסיות. התכולה של כל באר מעורבבת ומודגרת עם ריאגנט aPTT, המכיל פוספוליפיד, משפעל טעון שלילית של contact factor ובופר. לאחר משך ההדגרה, סידן מוסף על מנת לעודד את תהליך הקואגולציה. לאחר מכן נמדד הזמן של יצירת התקריש באופן אופטי באורך גל של 671 ננומטר בכל באר.
ה-PNT הוא כלי יעיל להערכת anti phospholipid syndrome) APS), שהוא מפגע אוטו-אימוני סיסטמי המאופיין על ידי נוכחות aPL, כולל LAs. מפגע ה-APS עלול לגרום להישנות קרישי דם, הפלות וסיבוכים תרומבוטיים אחרים. אם תוצאות APS מוגברות הדבר יכול להצביע על lupus anticoagulants (להלן LAs). התארכות אנומלית של aPTT היא בעלת אטיולוגיות אחדות, כאשר אחת השכיחות ביניהן היא הנוכחות של lupus anticoagulant (Corrigan ב-Am J Ped Hem/Oncol משנת 1980). Lupus anticoagulants הם אימונוגלובולינים המכוונים כנגד מגוון של פוספוליפידים אניוניים או כנגד קומפלקסים של פוספוליפידים וחלבונים וכתוצאה מכך מפריעים למדידות in vitro של קואגולציה התלויה בפוספוליפידים (Bevers וחב' ב-Thromb Haemost משנת 1991). בשנת 1983 Triplett וחב' הכניסו את בדיקת PNT, המבוססת על העיקרון שתוצרי ליזיס של טסיות ניטרלו את ההשפעה המעכבת של lupus anticoagulant (Triplett וחב' ב-Am J Clin Pathol משנת 1983).
ה-Reagents CRYOcheck Platelet Lysate מוכן מטסיות אדם בריא, כאשר תרכיז הטסיות מותאם להיות 250,000-300,000 טסיות/מיקרוליטר. הטסיות נאספות לתמיסת 105-109mmol/L sodium citrate dihydrate של אנטי-קואגולנט (3.2%). הפלזמה של המטופל מתקבלת על ידי סרכוז במהירות 1,500g למשך 15 דקות, על מנת להשיג פלזמה דלת-טסיות (פחות מ-10,000 טסיות/מיקרוליטר). יש לבחון פלזמה זו תוך 4 שעות בקירור (Feinstein ו-Rapaport ב-Prog Hemost Thromb משנת 1972). המדידות בוצעו תוך שימוש במכשור פוטו-אופטיקלי, שיוצר ניטרול של 2.1 שניות עם סטיית תקן של 1.1 שניות. גילוי מכני של התקריש יוצר ניטרול ממוצע של 3.7 שניות עם סטיית תקן של 1.2 שניות. על פי ההנחיות של ה-SSC, זמן קרישה בבדיקת PNT הגדול מ-3 סטיות תקן, נחשב לייצג LA חיובי. הפלזמה העשירה בטסיות של המטופל מוקפאת ומופשרת ומתבצעת בה בדיקת aPTT על פלזמה ענייה בטסיות ועל פלזמה מוקפאת ומופשרת. דרגת התיקון בין שתי הפלזמות מושגת ומחושבת. החשד שיש תרחיש של lupus anticoagulant קיים אם לדגימה נמצא aPTT מאורך לפחות שניים מתוך שלושה מאפיינים: עמידות של aPTT עם חלקים שווים של פלזמה נורמלית, מבחן של kaolin clotting time ו-dilute Russell's Viper Venom Time מוארך שלא תוקן עם פלזמה נורמלית.
הוראות לביצוע הבדיקה
יש ליטול דם למבחנת סודיום-ציטראט (פקק בצבע אפור) ולאחר סרכוז יש להעביר את הנוזל העליון למבחנת פלסטיק לצורך העברה למעבדה כפלזמה מוקפאת.
שיטת הבדיקה - Optical Clot-Based. יש לפסול דגימות פלזמה מאוד המוליטיות, ליפמיות או איקטריות.
ראו גם
המידע שבדף זה נכתב על ידי פרופ' בן-עמי סלע, המכון לכימיה פתולוגית, מרכז רפואי שיבא, תל-שומר;
החוג לגנטיקה מולקולארית וביוכימיה, פקולטה לרפואה, אוניברסיטת תל-אביב (יוצר הערך)