וילין-1 - Villin-1

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
וילין-1
Villin-1
מעבדה	אימונולוגיה
תחום	חלבון קריטי לתחלואת סרטן, מפגעי מעיים ומערכת העצבים.
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

מטרת הבדיקה

הבנה של מפגעים תאיים בתחומים רבים, בייחוד בקשר שלו עם אקטין.

כללי

וילין-1 הוא חלבון ספציפי לרקמה הקושר אקטין שמשקלו המולקולרי 95.5 קילו-דלטון, הכרוך לליבה של ה-brush border (‏Friedereich וחב' ב-J Biol Chem משנת 1999). וילין-1 מקודד באדם על ידי הגן VIL1 הממוקם בכרומוזום 2 באתר q35-q36. וילין-1 מכיל מספר מקטעים דמויי-gelsolin המכוסים על ידי מקטע קטן (8.5 kDa) של "מקטע ראש" בקצה ה-C-טרמינלי, המכיל צרור תלת-הליקסי המיוצב על ידי אינטראקציות הידרופוביות (Ghoshdastider וחב' ב-Ctytoskeleton משנת 2013). מקטע "הראש" נלמד באשר לדינמיקה המולקולרית שלו, בגין גודלו הקטן וכן בגין הקינטיקה המהירה של קיפול מהיר והרצף הראשוני הקצר (Bazari וחב' ב־Proc Natl Acad Sci USA משנת 1988, ו-Klahre וחב' ב-Plant Physiol משנת 2000).

המבנה

וילין-1 מורכב מ-7 מקטעים, מתוכם 6 מקטעים הומולוגיים המרכיבים את ליבת הקצה ה-N-טרמינלי ומקטע יחיד המרכיב את הקצה ה-C-טרמינלי. וילין מכיל שלושה אתרי קישור שהם phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIP2) שאחד מתוכם ממוקם ב-"head piece", והשניים האחרים ממוקמים בליבת החלבון (Meng וחב' ב-Biochemistry משנת 2005). מקטע הליבה מכיל בערך 150 חומצות אמינו הממוקמים בשישה החזרים (repeats). בליבה זו ישנו head piece שהוא C-טרמינלי הידרופובי בעל 87 חומצות אמינו הידוע כ-HP67, המורכב מ-70 חומצות אמינו מקופלות בקצה ה-C-טרמינלי. Head piece זה מכיל מקטע הקושר F-actin. שיירים K38 ,E39 ,K65 ,70-73:KKEK ,G74 ,L75 ו-F76 מקיפים את הליבה ההידרופובית, ואמורים להיות כרוכים בקישור של וילין-1 ל-F-actin. שיירים E39 ו-K70 יוצרים גשר מלח המופיע בתוך ה-head piece המשמש לקשירה של הקצוות ה-N ו-C טרמינלים. כִּסּוּי הידרופובי נוצר על ידי שייר W64 המשומר לחלוטין במשפחת הוילין. מתחת לכיסוי זה מופיע כתר חלופי חיובי או שלילי. וילין יכול לעבור מודיפיקציות בתר-תרגומיות כמו פוספורילציה של טירוזין (Panebra חב' ב־Am J Physiol Cell Physiol משנת 2001). וילין-1 הוא בעל אפשרות לעבור דימריזציה כאשר אתר הדימריזציה ממוקם בקצה האמיני של החלבון (George וחב' ב-J Biol Chem משנת 2007). ווילין מורכב משישה החזרים שכל אחד מהם מכיל 150 חומצות אמינו היצרות ביחד את מקטע הליבה המלווה על ידי headpiece קרבוקסי טרמינלי המכיל 87 חומצת אמינו (Glenney ו-Weber ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1981, Arpin וחב' ב-J Cell Biol משנת 1988, ו-Bazari וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1988). מקטע הליבה שומר על הפעילות התלויה ב-Ca+2 של capping, נוקלאציה וחיתוך, בעוד שהמקטע הטרמינלי של headpiece דרוש לאיגוד של הפילמנטים של אקטין, והוא נקשר ל-F-actin באופן בלתי תלוי ב-Ca +2 (‏Janmey ו-Matsudaira ב-J Biol Chem משנת 1988).

וילין, מבנית ותפקודית שייך לשתי קבוצות חלבונים. הקבוצה הראשונה מכילה את Duail, שהוא חלבון מאגד בדרוזופילה, הדרוש ליצירה של איגודים ציטופלזמטיים של F-actin בתאי שחלה (Mahajan-Miklos ו-Cooley ב-Cell משנת 1994), כמו גם ליצירה של פרוטו-וילין של Dictyostelium שסבורים שהיא הצורה הקדמונית של וילין (Hoffman וחב' ב-FEBS Lett משנת 1993). הקבוצה השנייה כוללת את החלבונים החותכים gelsolin (הצורה הגבישית, ו-scinderin שמוצאים ב-eukaryotes גבוהים (Kwiatkowski וחב' ב-Nature משנת 1986), וכן ליצירת fragmin ו-severin ב-eukaryotes נמוכים יותר (Ampe ו-Vandekerckhove ב-EMBO J משנת 1987, ו-André וחב' ב-J Biol Chem משנת 1988). בעוד שחלבונים מהקבוצה הראשונה מאוגנים בשבעה מקטעים כמו וילין, החברים בקבוצה השנייה הם בעלי ארגון הדומה למקטע של ליבת וילין. תפקידו של וילין בארגון מליבה המיקרו-וילית נקבע על ידי ניסויי רה-קונסטיטוציה in vitro (‏Coluccio ו-Bretscher ב־J Cell Biol משנת 1989). הוספה של וילין ו-fimbrin שהוא חלבון נוסף המאגד אקטין הכרוך בליבה המירו-וילרית, ל-F-actin הומוגני, מספיקה ליצירה של bundles עם מבנה בסיסי הדומה לזה של מיקרו-וילי של ה-brush border ‏in vivo. ‏hmhr, יצירת יתר של וילין בתאים בתרבית מרמזת לכך שווילין מסייע להתכנסות של תאגידי הליבה של מיקרו-וילי (Costa de Beauregard וחב' ב-EMBO J משנת 1995). תאים דמויי פיברובלסטים שעברו טרנספקציה עם cDNA המקודד לוילין, או שהוזרקו עם וילין, מכוסים על ידי מאגדים של פילמנטים של אקטין להם קשור וילין. אנליזה של מוטציות של וילין הראתה שמודיפיקציות מורפולוגיות אלו דורשות את המחצית הראשונה של הליבה המכונה villin 44T, ואת מקטע ה-headpiece. מקטע זה של וילין באדם מכיל בטרמינל הקרבוקסי שלו קבוצה של שיירים בסיסיים, החיוניים לפעילות המורפוגנית של וילין בתאים שעברו טרנספקציה. פפטידים הנובעים מאזור זה נקשרים ל-F-actin. ההחזר השני של מקטע הליבה (V2) מכיל שיירים בסיסיים החיוניים לפעילות החיתוך של תת-המקטע 44T villin

תפקוד

וילין-1 פועל בנוקלאציה, ביצירת capping ובהפרדה של סיבי אקטין. בבעלי-חוליות, וילין מסייע לתמיכה במיקרו-פילמנטים של המשערות (microvilli) של ה-brush border. עם זאת, עכברי knockout מראים microvilli נורמליים מבחינה אולטרה-מבנית, מה שמדגיש שהתפקיד של וילין אינו ברור באופן מוחלט אם כי הוא עשוי לשחק תפקיד בפלסטיות של התא דרך החיתוך של F-actin. הליבה של וילין עם ששת ההחזרים, אחראית לחיתוך של Ca2+ actin, ואילו ה-headpiece אחראי לקישור המשולב של אקטין שאינו תלוי בסידן. יש הערכה שוילין הוא החלבון המפקח על חיתוך האקטין המושרה על ידי Ca+2 ב-brushborder. סידן מעכב את הביקוע הפרוטאוליטי של המקטעים של הליבה ה-6 N טרמינלית המעכבת את חיתוך אקטין. בעכברים נורמליים רמות מוגברות של Ca+2 מושרות על ידי חיתוך אקטין על ידי וילין, בעוד שבעכברי knockout לוילין, פעילות זו אינה מתרחשת בתגובה לרמות מוגברות של Ca+2 (‏Revenu וחב' ב־Mol Biol Cell משנת 2007). בנוכחות רמות נמוכות של Ca+2, ה-headpiece של וילין, פועל לאגד את הפילמנטים של אקטין, ואילו כאשר ריכוזי Ca+2 גבוהים, ראשים N-טרמינלים חותכים את הפילמנטים האלה. הקשר בין PIP2 לבין וילין מעכב את ה-capping של אקטין ואת פעולת החיתוך ומגביר את קישור אקטין באזור ה-headpiece כנראה דרך שינויים מבניים בוילין. PIP2 מגביר את האיגוד של אקטין לא רק על ידי הפחתה בפעילות החיתוך של וילין אלא גם דרך הדיסוציאציה של חלבוני ה-capping, תוך שחרור המונומרים של אקטין מחלבונים מפרידים, ועידוד הנוקלאציה של אקטין וה-cross linking שלו.

תת המקטעים של וילין

תת המקטע ה-C-טרמינלי של ה-headpiece VHP67 של וילין המצוין כ-VHP35, מיוצב בחלקו על ידי שלושה שיירים של פנילאלנין. גודלו הקטן והתכולה ההליקלית הגדולה שלו מסייעים לקיפול מהיר, מה שאושר ניסיונית. המבנה ה-C-טרמינלי של וילין-4 שהוא VHP76, ב-Arabidopsis thaliana נמצא בעל זיקה גדולה יותר ל-F-actin בריכוזים מוגברים של Ca+2, מה שמדגיש ביתר את תפקידו של וילין.

דגרדציה ורגולציה

ההשערה היא שהרגולציה של וילינים בצמחים נגרמים על ידי דגרדציה דרך החלבון הנקשר auxin, המכוונן למקטע ה-headpiece. וילין-1 פועל כמשפיע על ההישרדות של של אפיתל המעי. בנוסף להגדרתו הקלאסית בתפקוד ציטו-סקלטלי שלו (קישור אקטין, ה-capping והחיתוך), וילין משמש גם כחלבון אנטי-אפופטוטי של תאי האפיתל (Friederich וחב' ב-J Biol Chem משנת 1999,ו- Wang וחב' ב-J Biol Chem משנת 2008).

מחלה דלקתית של המעי (IBD)

ב-IBD מצבים כגון מחלת קרוהן או קוליטיס כיבית, הביטוי של וילין-1 פוחת ברירית הדלקתית של המעי. הפחתה זו תואמת את איבוד חלבוני ה-tight junction ואת הסיגנל של Notch-1, מה שגורם להגברת החדירות של המעי ("leaky gut") וכמו כן מגבירה את הרגישות לאפופטוזיס המושרית על ידי ציטוקינים (Roy וחב' ב-Gastroenterology משנת 2018, Banerjee וחב' ב-Mucosal Immunol משנת 2009, ו-Dahan וחב' ב-Gastroenterology משנת 2011). רמת וילין בנסיוב זוהתה כסמן חדש לא-חודרני לנזק מעיים במטופלים עם שחמת (cirrhosis) חריפה וכשל של הכבד (Tonai וחב' ב-Alimentary Pharmacol משנת 2025). ריכוזים גבוהים של וילין תואמים גרדיאנט של חומרה במטופלים אלה ם מצב של דלקת סיסטמית ושיעורים גבוהים של תמותה תוך 90 יום. עם זאת, ביופסיה של רקמה במטופלים אלה מצביע על חסר של וילין-1 ברירית התריסריון, מה שמאשר יחס הופכי בין שלמות הרקמה ורמות וילין בנסיוב במהלך מצבי מחלה קשה.

נוגדנים

נוגדנים חד-שבטיים המזהים אפיטופ בקצה הקרבוקסילי של וילין אנושי, כמו גם הניקוי של נוגדנים אלה תואר בעבר (Dudouet וחב' ב-J Cell Biol משנת 1987). נוגדנים anti-mouse IgG מסומנים עם פוספטאז נרכשו מ-Amersham Pharmacia Biotech. מחברת Sigma נרכש rhodamine-conjugated phalloidin, ואילו N-Pyrenyliodoacetamide נרכש מ-Molecular Probes (Eugene, OR).

הוראות לביצוע הבדיקה

את הדם יש לדגום למבחנה כימית (פקק אדום) או למבחנת ספירת-דם (EDTA, פקק סגלגל). לאחר סרכוז תוך 4 שעות מנטילת הדם, יש להעביר נוזל עליון בקרור למעבדה.

הבדיקה מתבצעת בשיטת ELISA.

ראו גם

• חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה
• בדיקות מעבדה - סמנים סרטניים

המידע שבדף זה נכתב על ידי פרופ' בן-עמי סלע, המכון לכימיה פתולוגית, מרכז רפואי שיבא, תל-שומר;
החוג לגנטיקה מולקולארית וביוכימיה, פקולטה לרפואה, אוניברסיטת תל-אביב (יוצר הערך)