הצגת המקור של הדף "N-acetylgalactosamine-6-sulfatase"

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי={{רווח קשיח}}
|שם לועזי=N-acetylgalactosamine-6-sulfatase
|קיצור=GALNS
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=[[כימיה בלויקוציטים]]
|תחום=אבחון [[מחלת Morquio]]
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=פעילות האנזים > or =92 nmol/17 hour/mg protein.
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
==רקע==
[[תסמונת Morquio]] או mucopolysaccharidosis type IV (להלן MPS IV) היא [[מחלת אגירה]] ליזוזומלית נדירה העוברת בהורשה אוטוזומלית-רצסיבית. לתסמונת Morquio שני סוגים, A ו-B, המבוססים על חסר של 2 אנזימים ליזוזומליים שונים, N-acetylgalactosamine-6-sulfatase (להלן GALNS) ו-β-galactosidase, בהתאמה. הגן המקודד לאנזים GALNS מופה לאתר q24.316, ואילו הגן של β-galactosidase נמצא באתר 33p21.3. חסר של GALNS גורם להצטברות של [[glycosaminoglycans]] (להלן GAGs), דוגמת keratan sulfate (להלן KS) ו-chondroitin-6-sulfate (להלן C6S) ברקמות שונות ובעיקר בעצמות, בסחוס, במסתמי הלב ובקרנית, ואילו חסר של β-galactosidase מביא להצטברות רק של KS ברקמות אלו (Pedrini וחב' ב-Proc Soc Exp Biol Med משנת 1962, ו-Orii וחב' ב-Bone Metab משנת 1971). אף על פי שרוב הלוקים בתסמונת Morquio נראים נורמליים בלידה, הפגיעה בעצמות מתפתחת במהלך שנת החיים הראשונה. באחדים מהתינוקות עם תסמונת זו, בלידה עלולים להבחין בגבנון בעמוד השדרה, חזה בולט ומצח בולט. הדיספלזיה של השלד מאופיינת על ידי התגרמות בלתי מושלמת, מה שבולט בעיקר במצח בולט, תווי פנים עם סנטר גדול, צוואר קצר, עמוד שדרה תחתון דחוס, חסימה חלקית של הטרכיאה, גמדות גזעית קצרה ובלתי סימטרית, coxa valga (דפורמציה של צוואר הירך כאשר הזווית הנוצרת בין ראש וצוואר הירך לבין חוטר הירך גדולה מ-135 מעלות), pectus carinatum (התבלטות החזה מעל הצלעות), השטחה של כלוב הצלעות בגלל חולשת שרירי הבטן, genu valgum או רגלי X, מפרקים מעוותים, וכף רגל שטוחה (Hecht וחב' ב-Am J Med Genet משנת 1984, Hendriksz וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2013, ו-Matalon וחב' ב-Biochem Biophys Res Commun משנת 1974). עצם פגועה עם פלטת צמיחה נפגעת באופן חמור יותר. בשנת 1929 דיווח Morquio לראשונה על 4 מקרים בשוודיה של MPS IV, ובשנת 1971 תיארו Orii וחב' צורת ביניים קלה יותר של MPS IVA, כאשר רק בגיל 18 חודש אובחנה דפורמציה של החזה, בגיל 3 שנים אובחן [[kyphosis]], והליכה מוזרה בגיל 5. במקרה זה גובהו של המטופל בגיל 18 שנה היה 135 ס"מ עם אחדים מהפגמים בעצמות ועכירות של הקרנית.

חסר האנזים GALNS זוהה בשנת 1974, ובשנת 1977 דווח על מקרה הדומה ל-MPS IVA, אלא שהחסר האנזימטי שלו היה β-galactosidase, והוא הוגדר כ-MPS IVB (על פי Arbisser וחב' ב-Am J Med Gene). בתסמונת MPS IVA הדיספלזיה של העצמות יכולה להיות חמורה אך גם מתונה (Montaño וחב' ב-Am J Med Genet A משנת 2008, Tomatsu וחב' ב-Pediatr Endocrinol Rev משנת 2014, ו-Harmatz וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2015). אין חסר אינטלקטואלי בתסמונת Morquio A.

==פתו-פיזיולוגיה==
הצטברות יתר של GAGs כ-dermatan sulfate ,heparan,sulfate, chondroitin sulfate ו-keratan sulfate ברקמות שונות, גורמת לתווי פנים גסים, נזק ל-CNS, מפגעים של רקמת חיבור, דיספלזיה של העצמות ו-organomegaly. נמצא ש-GAGs מצטברים בליזוזומים כמו גם במשתית (matrix) התוך-תאית והחוץ-תאית. ישנם שבעה סוגי MPS, עם 11 אנזימים שונים החסרים. Keratan sulfate כרוך בתנועת התא, בהשרשת העובר ברחם, בשקיפות הקרנית, וברגנרציה עצבית (Funderburgh ב-Glycobiology משנת 2000).

==מחלה קרדיו-וסקולרית==
התבטאות לבבית של תסמונת Morquio כוללת [[התעבות של מסתמי הלב]]. שכיחה מחלה של המסתם הצניפי והמסתם האורטלי, התעבות שריר הלב, [[יתר לחץ-דם]] סיסטמי וריאתי, אם כי [[היצרות עורקים|היצרות העורקים]] הכליליים ו[[איסכמיה]] נדירים.

==בעיות שמיעה==
התבטאות אודיולוגית בתמונת Morquio כוללת זיהומים תכופים של האוזן התיכונה, אנומליות של האוזן הפנימית, ועיוות של 3 העצמות הקטנות של האוזן התיכונה, מה שגורם ל[[איבוד שמיעה]], עד כדי [[חירשות]].

==בעיות ראייה==
התבטאות אופתלמולוגית של התסמונת כוללת הפרעות ראייה ופוטופוביה, כמו גם התעכרות הקרנית כתוצאה מאגירת GAGs. בעיות נדירות נוספות כוללות התנוונות של הרשתית, מה שמפחית את הראיה ההיקפית, וכן [[עיוורון לילה]], [[גלאוקומה]], ו[[מחלת עצב הראייה]]. אנומליות אלו משפיעות על הראייה ועלולות להביא לעיוורון מוחלט.

==בעיות שלד==
היפופלזיה של מערכת השיניים היא אחד המפגעים הבולטים בתסמונת Morquio. נגע זה בולט בשילוב עם רפיון ליגמנטי, אי-יציבות סיבובית אטלנטואקסיאלית, ומשקעים אקסטרה-דוראליים של מוקופוליסכרידים, מה שעלול לשיתוק בארבעת הגפיים. סיבוך נוסף הוא cervical myelopathy העלול לפגוע בפעילות המעי ושלפוחית השתן, להידחסות עמוד השדרה התחתון.

==בעיות דנטליות==
בתסמונת Morquio בעיות דנטליות כוללות [[עששת]], שיניים שבירות, ושכבת enamel דקה במיוחד. ילדים עם התסמונת לוקים ברווחים גדולים בין השיניים. ל-enamel יש נטייה להתפורר. בתסמונת זו ל-enamel יש מופע דק עם חֶרְמֵשׁיות קטנות ומחודדות. מאפיינים נוספים הם שיניים חותכות בצורת עלה.

==אנליזה מולקולרית==
'''תסמונת Morquio A:''' הגן האנושי GALNS ממוקם ב-16q24.3 (על פי Baker וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1993, ו-Masuno וחב' ב-Genomics משנת 1993). אורך גן זה הוא בערך 50kb, ומכיל 14 exons ו-13 introns (על פי Nakashima וחב' ב-Genomics משנת 1994). אורכו של ה-spliced mRNA הוא 1566kb ומקודד לחלבון המכיל 522 חומצות אמינו. לאחר הרחקה על ידי ביקוע של ה-signal peptide שאורכו 21 חומצות אמינו, מתקבל האנזים הבשל GALNS, המורכב מתת יחידות של 40,000 דלטון, ושל 15,000 דלטון (Masue וחב' ב-J Biochem משנת 1991, ו-Tomatsu וחב' ב-Biochem Biophys Res Commun משנת 1991). האנזים GALNS הוא אחד מ-13 סולפטאזות הדומים זה לזה מבחינה אבולוציונית בגנום האנושי. כל הסולפטאזות הם בעלי דמיון של 20-35% בהרכב חומצות האמינו שלהן, והשייר C79 ב-exon 2 של GALNS האנושי משומר בכל הסולפטאזות במינים רבים של חיות. ציסטאין זה עובר מודיפיציה post-translational לשייר formylglycine על ידי sulfatase modifying factor 1 (על פי Cosma וחב' ב-Cell משנת 2003), ואנליזה מבנית מראה שהוא מהווה חלק חיוני באתר הפעיל של GALNS.

למעלה מ-400 אללים מוטנטיים של GALNS זוהו ב-250 מטופלים עם תסמונת Morquio A. מתוך אללים מוטנטיים אלה, 328 מוטציות שונות נמצאו גורמות לפנוטיפ הפתולוגי של המחלה עד אוקטובר 2016 (על פי Sukegawa וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 2000, Fukuda וחב' ב-J Clin Invest משנת 1992, Tomatsu וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1995, Kato וחב' ב-Hum Genet משנת 1997, Montaño וחב' ב-Hum Genet משנת 2003, Tomatsu וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2007, ו-Morrone וחב' ב-Hum Mutat משנת 2014).

מוטציות missense/nonsense אחראיות ל-243 מוטציות (74.1%), כאשר השאר הן 32 מוטציות שמט (deletion), וכן 32 מוטציות splicing site, ו-5 מוטציות החדרה (insertion). המוטציות השכיחות ביותר הן מוטציות missense הבאות: p.R386C, p.G301C ו-p.l113F. מוטציות אלו התגלו בחולים מרקעים אתניים אחדים (Fukuda וחב' ב-Hum Mutat משנת 1996, Bunge וחב' באותו כתב עת משנת 1997, ו-Tomatsu וחב' באותו כתב עת משנת 2005). עשר המוטציות השכיחות ביותר ב-GALNS אחראיות ל-35% מכל מקרי תסמונת Morquio A. האנליזה המולקולרית מתבצעת בדרך כלל בטיפות דם מיובשות.

'''באשר לתסמונת Morquio B''', הגן האנושי המקודד ל- β-galactosidase ממוקם על הזרוע הקצרה של כרומוזום 3 בעמדה 33p21.33 ואורכו של גן זה בערך 60kb, והוא מכיל 16 אקסונים. ה-cDNA מקודד ל-677 שיירי חומצות אמינו. Paschke וחב' דיווחו ב-Hum Genet משנת 2001, ש-14 מתוך 15 מטופלים אירופיים עם תסמונת Morquio B הכילו מוטציית missense זהה, p.W273L.

==מחקרים הדמייתיים==
טכניקות הדמיה כגון [[צילומי X]], כמו גם [[CT]] ו-[[MRI]] משמשים לעיתים קרובות להערכה והתנהלות בתסמונת Morquio.שיטות הדמיה אלו משמשות לקביעת דרגת הדחיסות ואי היציבות של עמוד השדרה הצווארי, וכן להערכת ההיצרות של עמוד השדרה. בהדמיה ניתן לגלות kyphoscoliosis, נקע קדמי בשליש המרכזי של עמוד השדרה, ואי סדירות של הצלעות. שיטות הדמיה עשויות לגלות חסימה בצינור הנשימה (Tomatsu וחב' ב-Mol Genet Metabol משנת 2016).

==מודלים בחיות==
כדי להבין במלואה את תסמונת Morquio, פותחו מודלים בחיות (Haskins ב-Acta Pediatr משנת 2007, ו-Xu וחב' ב-Ann N Y Acad Sci משנת 2016. טכניקות של ביולוגיה מולקולרית וריקומבינציה שימשו להנדס מודלים בחיות לתסמונת זו (Hall וחב' ב-Curr Protoc Cell Biol משנת 2009). בשנת 2000 דיווחו Montaño וחב' ב-Biochim Biophys Acta, על הבידוד והביטוי של cDNA של GALNS בעכברים, על המיקום הכרומוזומלי שלו, על המבנה הגנומי שלו ועל אנליזת ה-promoter של הגן המקודד ל-GALNS בעכברים. האורך המלא של cDNA של GALNS בעכברים מקודד ל-520 חומצות אמינו, אנזים הקצר ב-2 חומצות אמינו בהשוואה לאנזים האנושי. הרצפים של הנוקלאוטיד וחומצות האמינו של עכברים ובני-אדם זהים ב-83% וב-84%, בהתאמה. הגן של GALNS בעכבר ובאדם מכילים 14 אקסונים ו-13 אינטרונים, והאורך של שניהם הוא בערך 50kb, מה שמצביע על דרגת שימור גבוהה של הגן הזה בשני המינים.

המודל הראשון בעכברים של תסמונת Morquio A יוצר בשנת 2003. מודל זה הוא עכבר knockout קלאסי (galns-/-), שאינו מייצר mRNA של GALNS כתוצאה משמט (deletion) ב-intron 1 וב-exon 2 (על פי Tomatsu וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 2003). אגירה בליזוזום נמצאה בעיקר בתאים רטיקולו-אנדותליאלים, כגון תאי Kupffer ותאים סינוסואידליים בטחול בגיל חודשיים. בנוסף, נתגלתה אגירה ליזוזומלית במוח, בנוירונים של ההיפוקמפוס, בנוירונים נאוקורטיקלים, ובתאי קרום המוח. צילומי X לא הראו שינויים בעצמות העכברים עד גיל 12 חודשים. לאחר 50 דורות של עכברים אלה הפנוטיפ של מודל galns-/- נעשה חמור יותר, עם הצטברות GAG בכונדרוציטים וברקמות נוספות. בשנת 2007 הונדס מודל עכבר knockout עם גנוטיפ Galnstm (C76S) slu, בו הציסטאין באזור הפעיל של האנזים הוחלף ב-serine (חחC76S) על ידי targeted mutagenesis (על פי Tomatsu וחב' ב- Mol Genet Metab).

מודל העכברים Galnstm(C76S)slu הכיל אגירה ליזוזומלית בתאי Kupffer, בתאי ההיקף של הסינוסים בטחול, בתאי סטומה של מסתמי הלב, בתאי האפיתל הגלומרולריים בכליות, בכונדרוציטים, ובנוירונים בהיפוקמפוס (Venn ו-Mason ב-Biochemical J משנת 2005). פנוטיפ העצמות במודלים אלה בעכברים, מתון יותר מאשר זה שמוצאים במטופלים עם Morquio A. ההסבר האפשרי לכך, הוא החוסר של di-sulfated KS בעכברים ובחולדות (Dahms וחב' ב-J Biol Chem משנת 1989). עם זאת, מודלים אלה בעכברים מכילים mono-sulfated KS שמוצאים בפרוטאו-גליקנים המופיעים בסחוס, בגידים, בליגמנטים ובעצם (Neufeld ב-Enzyme replacement therapy משנת 2006).

==אפידמיולוגיה==
Morquio A מופיע ב-1 מתוך 216,000 לידות במערב קנדה (Lowry וחב' ב-Hum Genet משנת 1990), ב-1 מתוך 76,000 לידות בצפון אירלנד (Nelson ב-Hum Genet משנת 1997), ב-1 מתוך 201,000 לידות באוסטרליה (Meikle וחב' ב-JAMA משנת 1999, ב-1 מתוך 450,000 לידות בפורטוגל (Pinto וחב' ב-Eur J Hum Genet משנת 2004, וב-1 מתוך 625,000 לידות ביפן (Tomatsu וחב' ב- Curr Pharm Biotechnol משנת 2011). תסמונת Morquio B שכיחה הרבה פחות.

==פרוגנוזה==
אלה עם צורה חמורה של תסמונת Morquio יכולים לפתח בגיל צעיר היצרות של עמוד השדרה הצווארי (cervical myelopathy) (על פי Khan וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2017). אלה עם צורת המחלה הקשה מתים בעשור השני או השלישי לחייהם אם אינם מטופלים. שני שלישים מהחולים מתים ממצוקה נשימתית וכן ממפגעים לבביים כפגיעה במסתמים, ויכולת מוגבלת של תנועת חזה (Kampmann וחב' ב-PLos One משנת 2016). אלה עם צורת מחלה קלה יותר שרדו עד לעשור השביעי לחייהם.

==שיטות למדידת רמת GALNS==
מדידת פעילות GALNS בפיברובלסטים ובלויקוציטים בחשודים לתסמונת Morquio, רגישה לשינויי טמפרטורה כך שיש להקפיד על שמירת הדגימות בקירור ושליחתן למעבדה בתנאי קירור. גם ייבוש דגימת הדם על כרטיסים בנוסח Guthrie כאשר יש קשיים לוגיסטיים בהעברת תאים חיי למעבדה, מושפע משינויי טמפרטורה. לכן יש להקפיד להעביר דגימות נוזליות או מיובשות למעבדה סמוך ככל האפשר למועד נטילת הדם, וזאת בקירור.

מעבדות רבות משתמשות בבדיקה המבוססת על מצע פלואורוגני (van Diggelen וחב' ב-Clin Chim Acta משנת 1990). הבדיקה עושה שימוש ב-4-methylumbelliferyl-ß-D-galactopyranoside-6-sulfate (להלן 4MU-Gal6S) כמצע. האנזימים GALNS ו- ß-galactosidase בדגימות מסירים 6-sulfate ו-galactoside, בהתאמה. Methylumbelliferone המשתחרר זוהר באופן פלואורסצנטי ב-pH גבוה (Cozma וחב' ב-PLos One משנת 2015). שיטה למדידה כמותית של פעילות GALNS פותחה על ידי שימוש במצע חדש (GalNAc-6-S-C6/C6-Bz) על ידי tandem mass spectrometry (על פי Kumar וחב' ב-Clin Chem משנת 2015). לצורך זיהוי תסמונת Morquio B, פעילות β-galactosidase נמדדה בפיברובלסטים או בלויקוציטים, כאשר הבדיקה הפלואורומטרית לרוב משתמשת ב-p-nitrophenyl β-galactopyranoside או ב-4methylumbelliferyl-ß-galactopyranoside כמצעים לפעילות האנזים.

רמות KS בנסיוב ובשתן מראות מתאם חיובי עם החומרה הקלינית של MPS IVA (Tomatsu וחב' ב- J Inherit Metab Dis משנת 2010, Hintze וחב' ב-Biomark Insights משנת 2011, Martell וחב' ב-Bioanalysis משנת 2011, Dũng וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2013, ו-Tomatsu וחב' ב- Pediatr Res משנת 2004). פותחו מספר שיטות מדידה של רמת KS בנסיוב ובשתן, כולל שיטת עיכוב ELISA (על פי Tomatsu וחב' ב-J Inherit Metab Dis משנת 2005), שיטת sandwich ELISA (על פי Oguma וחב' ב-Biomed Chromatogr משנת 2007), ושיטת liquid chromatography–tandem mass spectrometry (להלן LC-MS/MS) (על פי Oguma וחב' ב-Anal Biochem משנת 2011, ו-Rowan וחב' ב-J Inherit Metab Dis משנת 2013). שיטות אלו שופרו על ידי קבוצות אחרות (Tomatsu וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2010, Auray-Blais וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2011, ו-Shimada וחב' ב-JIMD Rep משנת 2015).

רמות keratan mono-sulfated ו-keratan di-sulfated בנסיוב ובשתן גבוהות משמעותית בחולים צעירים עם תסמונת Morquio בהשוואה לבני גילם הבריאים. העלייה ברמות di-sulfated KS יותר משמעותיות מאשר רמות mono-sulfated KS. שיטה כמותית למדידת C6S גם כן פותחה תוך שימוש ב-LC-MS/MS. שיטה זו מפרידה די-סכרידים של C6S מדי-סכרידים אחרים בדם ובשתן. צירוף הנתונים של KS ו-C6S עדיף על נתוני כל אחד משני GAGs אלה לבדו, בהבדלה בין נבדקים עם התסמונת הזו, לבין נבדקי ביקורת מותאמי-גיל.

==הוראות לביצוע הבדיקה==
את הדם יש ליטול במבחנת ליתיום הפארין (פקק ירוק), לשמור את הדגימה בקור ללא סרכוז והפרדת הפלזמה מהתאים, והיא חייבת להגיע במהלך 7 ימים למעבדה בקירור. דגימת דם המוליטית תיפסל.